实验问答4,424,009 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问求教，大片段目的基因（6700bp）如何获取？

府宅

可以根据数据库选择表达量高的部位进行模板制备，这样的话，也比较容易扩增出来；可以分成两三段就可以了，选择合适的酶切位点；再次，选择高保真的聚合酶，这样扩增出来不容易出现突变，可以适当提高循环数，增大产量，可以设置梯度PCR，寻找最优的条件。

3 回答221 围观

问如果把不同个体的同一个基因的片段装在一块，那这个基因还能用吗？

迟C迟

最好不要用，不同个体同一个基因可能存在SNP，不同的基因序列在实验后期得到的结果将是不可信的。

3 回答79 围观

问请问有什么办法可以扩GC含量高的片段吗？

迟C迟

可以购买生物公司专门的聚合酶，是专门对高GC含量的, 当扩增具有复杂的二级结构 (GC rich等) 的模板或具有重复序列的模板时,使用GC Buffer进行PCR扩增将非常有效。

4 回答129 围观

问扩CDS区，前后大概各50bp左右没扩出来，请问这可以算把它的全长扩出来了吗？

迟C迟

肯定不能算CDS全长，几乎丢了100bp，就是30多个氨基酸，可能重要功能区都丢了，建议重新设计引物扩增。

3 回答85 围观

问荧光定量pcr检测，每个样品需要做几次，为什么？

天一湖医者

最多一个样品一次，反应用两个重复，以防有明显的操作失误。如果两个孔的数据很接近，就取平均值作为一个值来看待。如果2者差别很大，说明有操作失误，这个样本的结果就不能要，需要重做。

5 回答1662 围观

问STR引物设计如何开始呢？

天一湖医者

引物以18～30bp为宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物内部和引物之间不应含有互补序列；引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%；引物的3’末端与模板DNA一定要配对，但末端没有严格的限制，故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等；引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”；引物的终浓度一般为0.2～0.5μmol/L，过

2 回答386 围观

问实时定量PCR进行比较时，需要进行统计吗？如何进行统计学分析？

秋秋欣欣

需要进行统计分析的，计算样本的平均±SD,CV

2 回答149 围观

问pcr实验扩增曲线重复性不好怎么办呀～

迟C迟

1、引物特异性不好，扩增出多个目的条带会有波浪形扩增曲线。2、严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线，轻微的蒸发会是一种缓慢的上升，这些异常的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。

4 回答125 围观

问PCR扩增，扩增后进行1%电泳，没有条带

秋秋欣欣

那会不会是酶有问题呢，以及变温温度是否合适。

3 回答85 围观

问qRT-PCR内参的选择问题

秋秋欣欣

CT值太小可以将样本稀释一下，另外其他两个内参变化大的话可以是其他原因，可以调整一下再看看

3 回答162 围观

问求助｜茎环法miRNA做RT-PCR内参和目的基因CT值差距大

秋秋欣欣

如果内参齐，然后目的ct值差异比较大，但是稳定的话也是可以用的

2 回答985 围观

问请问，做qPCR实验，提取样品的RNA达到怎样的标准（如OD值，260/280），才比较符合做qPCR的实验的质量？

汤姆卜丽波

浓度要高一点，至少100+，然后260/280在2.0左右比较纯

3 回答925 围观

问普通PCR跑出来的产物能定量比较么

秋秋欣欣

电泳只是能够看个大概，定量是不行的

7 回答260 围观

问如何设计上下游引物引物，然后提质粒，并把目的基因转染到质粒里?

汤姆卜丽波

根据你目的基因的序列设计引物然后扩增，通过酶切连接，合成重组质粒

3 回答121 围观

问qpcr用水代替模板上机，结果仍然有曲线，是引物的问题还是被污染了？

bamboopiggy

可能是引物二聚体，也可能是水被污染了，这个要更换其中一个进行判断

3 回答125 围观

问PCR溶解曲线虽然为单峰,但峰看起来有点宽说明什么?

bamboopiggy

说明你的引物不特异，有两个size差不多大小的产物产生

3 回答110 围观

问PCR实验中，我的目的条带有出来，但是野生型的条带却未出来，这是为什么？

迟C迟

首先要确定野生型和你的样本之间目的基因的差异，是不是你的样本目的基因存在特异性，野生型就无法扩增出特异的目的基因。

3 回答87 围观

问荧光定量PCR的基线，是怎么确定的呢？

bamboopiggy

基线就是一开始基本没有读值的那些线啊，你说的应该是读CT值得那个threshold 线吧，那个就是斜率最大得地方，的一条线，现在基本由机器自己去判断了

3 回答431 围观

问我做PCR实验，有关引物的问题？

bamboopiggy

如果不加模板也能扩增出目的条带，就是说明引物或者你加进去的东西中的某一样污染了

3 回答186 围观

问SYBR GREEN I染料需要严格避光吗？

bamboopiggy

不用那么严格，就是加好板子以后，如果不能立刻上机，最好避光保存。加板子的时候不用

6 回答825 围观

1
•••
27
28
29
30
31
•••
54
跳至页

提问

48 小时有问必答

扫一扫

添加小程序

关注公众号

反馈

TOP

打开小程序