小鼠原代神经元活细胞成像观察如何驱动自噬体运动？
阳阳0602
麻烦请教一下，有人做过小鼠原代神经元活细胞成像观察前的饥饿（或其他方法）诱导自噬吗？我们提取的C57胎鼠原代神经元种植后，正常培养在Neurobasal培养基内（Neurobasal+B27+GlutMAX+双抗），转染了GFP-LC3和目标蛋白A质粒48h后，准备在活细胞工作站中观察A对神经元轴突中自噬体（GFP-LC3）的运动情况。查阅文献大多是在活细胞观察前3h左右进行饥饿处理来诱导自噬，但是这个饥饿的方法并不明确。我们自己做了几次尝试，观察前将Neurobasal培养基全部换成了EBSS，甚至加入了自噬诱导剂，但是最终还是没有观察到神经元中GFP-LC3的移动，不论是轴突、树突、胞体都没有观察到。现在就困惑于此，不知道是转染后时间问题，还是活细胞观察前的诱导问题，亦或者还有其他没有注意到的问题。如果有大神做过类似的实验，还望能够不吝赐教，万分感谢。
2 个回答
loveliufudan
以下是一些建议：
饥饿处理：饥饿是一种广泛应用的自噬诱导方法。但是，您需要确定饥饿处理的时间和条件。通常来说，饥饿处理的时间在数小时到数十小时之间，取决于处理的类型和实验的目的。EBSS是一种无营养的缓冲液，可以诱导自噬。在EBSS中处理的时间一般为2-6小时，但也可以更长时间处理。另外，您需要控制EBSS的pH，将其维持在7.4左右。
药物处理：常用的自噬诱导剂有Rapamycin、Chloroquine、Bafilomycin A1等，您可以尝试其中的一个或组合使用。请注意药物的浓度和处理时间，以及对神经元细胞毒性的影响。
转染：您已经转染了GFP-LC3和目标蛋白A质粒，但是需要注意转染后的时间和转染的效率。建议您在转染后24小时开始处理，因为这个时间点转染的效率最高，而且细胞对转染后的蛋白表达的适应期较短。
活细胞成像前的处理：您需要将培养基换成适当的成像缓冲液，例如Hank's Balanced Salt Solution（HBSS）。这可以防止成像前细胞内环境的变化，并使细胞保持活性。建议您在处理前将细胞培养在HBSS中至少30分钟，这有助于使细胞适应新的环境。
毛利小五郎的徒弟
可以做时间梯度进行饥饿诱导，我们一般设置3h，5h，6h三个时间点进行饥饿
阳阳0602
谢谢啦，麻烦再问一下，您说的饥饿诱导，是把Neurobasal无血清培养基更换成EBSS或者其他缓冲液来进行饥饿诱导的吗？
