基因回补具体实验步骤

实验步骤

1.将供体菌和受体菌分别接入5ml LB培养液中,37℃振荡培养过夜。

2.将供体菌与受体菌按1∶1进行混合于无菌试管中,置37℃轻摇30min。

3.将4组混合物分别稀释至10^-5;各取10^-4、10^-5稀释液0.1ml分别涂布在含链霉素和色氨酸平板上,同时取供体菌和受体菌液0.1ml分别涂在以乳糖作为惟一碳源的基本培养基(含VB1)平板上作为对照,置37℃培养2d。

4.观察平板上长出的菌落并计数。从4种互补实验平板上各随机挑选几个菌落分别在EMB乳糖平板上画线分离,将平板置于37℃培养2d。

5.观察EMB乳糖平板上长出的菌落是否有分离现象。

6.将4种实验菌株及EMB乳糖培养基上长出的互补菌落(共12株)分别接种在含乳糖的5mlLB液体中,置37℃振荡培养过夜

7.过夜培养物经4000×g室温离心10min,去上清液;用基本缓冲液洗涤菌体后制成悬浮菌液,调节细胞密度至OD600≈0.3。取1ml菌液,加1滴甲苯,立即振荡10s,打开试管置37℃摇动40min以除去甲苯,然后在37℃水浴中按以下程序进行β-半乳糖苷酶的定量测定。

副溶血弧菌基因回补实验方法的建立

重组质粒的构建和鉴定 利用限制性内切酶Xba I和 Hind Ⅲ对载体pBAD33和目的基因片段aphA、 opaR分别进行双酶切,将aphA和opaR基因酶切产物和质粒酶切产物按6:1摩尔比,经TDNA连接酶4℃连接12 h。连接产物化学转化入E.coli DH5a感受态细胞,涂布于Cm 10 ug/ml抗性的LB平板,37 ℃恒温倒置培养至出现单克隆菌落。

设计并合成质粒pBAD33的引物:上游引物 pBAD33-F为5'-ATGCCATAGCATTTTTATCC-3';下游弓物pBAD33-R为5'-GATTTAATCTGTATCAGG-3'分别挑选单克隆,以aphA-F/pBAD33-R,aphA-R pBAD33-F,aphA-F/R和pBAD33-F/R为引物对,进行 aphA基因重组质粒的普通和搭桥PCR鉴定;以opaR-F/ pBAD33-R,opaR-R/pBAD33-F,opaR-F/R和pBAD33- F/R为引物对,进行opaR基因重组质粒的普通和搭桥 PCR鉴定,PCR反应参数同前。同时以pBAD33-F/R为引物,进行空质粒pBAD33的PCR反应,以作对照。对 PCR鉴定阳性的菌株用QIAGEN质粒提取试剂盒提取质粒,质粒送公司进行核苷酸测序,测序引物为 pBAD33-F/R。

副溶血弧菌基因回补株的构建 将重组质粒 pBAD33-opaR和pBAD33-aphA分别电转化相应的VP突变株AopaR和ΔaphA的感受态细胞,电击参数为25 uF200 Ω,2.5 kV,将菌液密涂Cm 5 ug/ml HI-0.5%平板。37 ℃倒置培养过夜。挑取单克隆,分别以aphA-F/R和 opaR-F/R为引物,进行PCR鉴定,PCR鉴定阳性的菌株即为VP的基因回补株C-ΔaphA和C-ΔopaR。

基因回补贝体实验（gene knock-in）是一种基因编辑技术，用于将外源DNA序列导入到目标细胞的基因组中。下面是一般的基因回补贝体实验步骤：

选择适当的细胞系，包括能够适应您的实验要求的细胞类型，例如HEK293T，CHO等。

构建载体。在一个表达载体中，将选择的外源DNA序列构建到相应的导入载体中。可以通过PCR扩增、亚克隆、基因合成等方法构建载体。

贝叶斯实验。将构建的载体转染至目标细胞，例如HEK293T细胞。可以使用化学法、电转法等多种转染方法。

筛选阳性克隆。在贝叶斯实验完成后，根据基因回补贝体实验的实验要求，筛选带有外源DNA序列的阳性克隆细胞。

鉴定阳性克隆。利用PCR、Southern blot、Western blot等方法进行鉴定，确认是否达到预期效果。

扩增阳性克隆。利用体外培养等方法扩增阳性克隆。

以上是一般的基因回补贝体实验步骤，具体操作应根据实验要求进行调整。