Red重组法基因敲除固体平板长出菌落，为什么转到液体培养基就不长了？
dxy_78gwqva3
我们设计了含敲除基因同源臂的引物，以Pkd4为模板PCR，结果长度是吻合的。Pkd4的两段引物为“同源臂39bp+gtgtaggctggagctgcttc和同源臂39bp+catatgaatatcctccttag”，应该也是没有问题的，引物设计是是把Pkd4的FRT包含进去的。但是我们把Pkd46导入菌后，制备电转感受态（全程加100mmol/L L-阿拉伯糖），把PCR片段电转以后用含卡那霉素固体培养基32小时左右长出了菌落，但是接到含卡那霉素的液体里面就完全不长。
我们的Pkd46是改造过的，因为菌株本身抗氨苄，我们就插入了氯霉素抗性基因，但是对阿拉伯糖操纵子应该是没有影响的吧？
阿拉伯糖的浓度太高会影响诱导吗？是没有诱导出重组酶吗？
是抗生素浓度不对吗，卡那霉素用的50ug/mL？
这个问题太困扰了，求大神解答！
3 个回答
土井挞克树
阿拉伯糖的浓度太高会影响诱导，卡那霉素的浓度需要降低一些
huarenqiang5
插入了氯霉素抗性基因，对阿拉伯糖操纵子没有影响。
一般加入阿拉伯糖的浓度 为0.2%-0.5% L-阿拉伯糖的LB液体培养1ml。
loveliufudan
从你提供的信息来看，可能有几个可能性导致转入液体培养基后没有出现菌落。
首先，可能是电转化的效率不高，导致只有少量的细胞发生了重组。这种情况下，使用固体培养基可以增加细胞的聚集，从而有助于重组细胞形成菌落。在液体培养基中，细胞的分散性增强，这可能导致重组细胞的聚集性不足，从而无法形成菌落。
其次，可能是电转化后的细胞存活率不高，或者细胞的生长速度太慢，导致在液体培养基中无法形成菌落。这种情况下，可以尝试调整电转化条件或优化培养基配方，以提高细胞存活率和生长速度。
另外，卡那霉素的浓度是否合适也可能会影响到菌落的生长。如果卡那霉素的浓度太高，可能会导致对细胞生长的抑制，从而影响到重组细胞的生长和形成菌落。建议根据具体的菌株和卡那霉素的最小抑菌浓度来确定卡那霉素的使用浓度。同时，阿拉伯糖的浓度也需要适当控制，以避免对细胞生长造成影响。
最后，建议检查引物设计是否正确，并进行确认。如果引物设计存在问题，可能会导致PCR扩增产物不准确，从而影响到电转化和重组的结果。
