病毒滴度和感染复数MOI预实验有具体的实验步骤吗？

第一天：铺板。

设置MOI梯度：可以按照不加病毒,10,20,30,50,80,100来设置MOI梯度，或者根据实际情况设置梯度都可。不加病毒组是用来判定细胞状态的。

注：最好设置一组复孔。

细胞接种：一般用24孔板接种2×10 4个细胞左右。如果细胞特别大可以适当减少，特别小可以增加。原则上以第二天汇合度达到30%-40%为宜。

放入培养箱培养

第二天：加病毒。

按照设置好的MOI算好每孔需要加的病毒量。每孔加病毒量(μl)=MOI×细胞数/滴度(TU/ml) ×1000。

注：一般第二天细胞数按照倍增来算。

例如：病毒滴度1×108TU/ml，接种细胞数2×104，MOI=10。那么，病毒量=10×4×104/1×10 8×1000=4μl

加慢病毒。按照算好的病毒量吸取病毒原液加入培养基中，摇动孔板混匀。

注：如果病毒滴度太高，每孔加的病毒太少，移液器量程不够可以先将病毒稀释后再加。稀释倍数根据实际情况来定，稀释液用无血清培养基、Opti-MEM、PBS都可以。

加Polybrene：加完病毒的孔中再加入Polybrene，终浓度5μg/ml，摇动孔板混匀。

注：Polybrene对部分细胞毒性很大(比如原代神经元，树突细胞等)，不要加。如果实在不知道应不应该加，可以增加一组预实验，只加Polybrene不加病毒，跟都不加的组对比。

放入培养箱继续培养

第三天：换液

提前37℃预热培养基。

弃去含病毒的旧培养基，加入预热好的新鲜完全培养基。

放入培养箱继续培养。

第五天：观察，拍照，确定合适的MOI值

在荧光显微镜下观察，并拍照。

确定合适的MOI值。

第一天:细胞接种

1)设置MOI梯度

设定病毒MOI，可选择0，20，40，60，80，100的梯度设置，或根据实际实验需求设置。

2) 分组

为了确定感染条件，按照不同培养条件进行分组:

Control组，不感染病毒，监控实验期间细胞生长情况。

M组，常规培养组，观察常规培养条件下病毒对细胞的感染效果:再按病毒MOL梯度

分为不同小组。

B组，添加病毒试剂(感染增强剂)，观察是否提升病毒感染效果:可在MOL确定后，

以目标MOI进行感染效果比较。

注:B组可选择不同的病毒试剂，以了解最佳感染效果;最好设置一组复孔，以保证实验结果的可靠性。

3)细胞接种

将状态好的目的细胞接种于细胞培养容器中，计数后完成铺板。以 96 孔板为例，用完全培养基制备2mL密度为125x105个/mL的细胞悬液，按80uL/孔加入板中。按照上述完成的分组加入病毒和试剂。

4)感染前准备

取出病毒在冰上融化，用无血清培养基稀释至目标滴度。

5) 感染操作

在板孔中加入对应体积的溶液，感染后8-12 hrs向每孔中加入100uL常规培养基，保持细胞正常生长。

6)感染后换液

悬浮细胞换液，收集孔板中细胞至干净的EP管中，2000rpm离心2min收集沉淀，加入完全培养基轻轻混匀后，转移至培养板继续培养。

贴壁细胞换液时，在培养器皿中心小心吸取旧培养基，后更换枪头注入新鲜培养基，沿培养皿壁往下缓慢的注入，避免冲散贴壁的细胞。

第二至三天:继续培养

中间可换液，保持细胞活性。换液方式同“感染后换液”。

第四天:观察感染效率，进行后续实验

感染后72 hrs，在荧光显微镜下观察细胞，估计病毒感染目的细胞的效率。若荧光弱，可到96hrs后观察。根据实际感染情况，调整 MOI。

感染条件及 MOI的选择原则

1)感染效率80%左右且细胞生长良好的组所对应的感染条件和MOI可作为后续实验的参

考依据;

2)在细胞形态不受影响的情况下，尽可能用少的病毒感染细胞;

3)病毒试剂Polybrene对部分细胞毒性较大(如原代神经元，树突细胞等)，不确定是否

添加时，可增加一组实验。即只加病毒试剂Polvbrene不加病毒，跟control组进行比较细胞生长情况。

1. 第一天 细胞的准备
将目的细胞接种于96 孔板中，细胞融合率为 50%为最佳。为保证细胞生长良好，请保 证细胞贴壁过夜。
2. 第二天 病毒的稀释
取10μL 慢病毒原液加入 90μL 培养液中做1:100 稀释（10-2），以此为起点做梯度稀 释直至稀释10-7。可根据实际情况降低或提高稀释倍数。
3. 第二天 感染目的细胞
取出提前准备好的96 孔板，用准备好的病毒稀释液替代旧培养液，注意保留未加入病 毒的细胞孔作为对照组。
4. 第二至十天 观察荧光或检测
慢病毒对细胞的感染较慢，请在感染细胞后 48、72、96、120小时分别观察细胞中荧光 表达情况（如果您选择的产品不带有荧光标签，请在 48、72、96、120小时分别收获细 胞并通过 Western-Blot 或其他检测手段来检测基因表达）。
注意事项：由于不同细胞对慢病毒感染过程的承受能力不同，在加入病毒稀释液后，
请于 12-24 小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适。