免疫荧光双标操作方法以及注意事项有哪些？

两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

每次试验均需设置以下三种对照：

（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物；

（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物；

（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。