染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达密切相关。根据“组蛋白密码”假说，组蛋白的各种共价修饰的组合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能，因此，ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。 该技术主要应用于： 1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记” 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损失

一.实验目的 1.掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2.学习DNA的限制性酶切的基本技术 3.掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二.实验原理 1984 年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组 成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA 指纹图谱，开创了检测DNA 多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种

单拷贝克隆产量低，高拷贝克隆稳定性差，一直让研究者在克隆 表达时难以选择。蛋白的表达就有诱导表达系统，可以实现人为地控制蛋白的表达时间和表达量——现在连质粒的拷贝数可以借助诱导的方法来人为控制了！Epicentre的专利技术——CopyControl克隆 系统能够让您共享单拷贝和高拷贝的优点。CopyControl克隆，首先以单拷贝形式生长——单拷贝可以确保插入稳定及成功克隆，编码毒性基因序列——在需要的时候，再诱导成高拷贝克隆，以便下游应用所需。这一系统可以用来构建PCR克隆，对于BAC，fosmid文库等大型质粒格外有用。 一、CopyControl克隆系统有两个重要的成分： （一）CopyControl pCC1 Vector. 这个载体含有两个复制起始位点（如图1）：单拷贝的大肠杆菌F

【实验目的】 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细

按照RNA分离操作方案在完全移去水样层后，匀浆中的DNA存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后，DNA溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL试剂从组织和培养细胞中完全回收的DNA可以用来做样品中DNA含量的测定。同时抽提的基因组DNA可以用于对Northern analysis的结果进行标准化，因为DNA变异程度比总RNA或组织重量要小。[由于来源的不同，所得到的DNA沉淀在进一步应用前可能需要额外的纯化步骤（例如苯酚抽提等等）。] 实验所需但试剂未提供的物品： _酒精 _0.1_M柠檬酸钠（用10%酒精配制） _75~7酒精 8 mM NaOH 如无例外，以下操作均应在15�30℃下完成。 1.DNA的沉淀 移除中间层上残余的水样层，

一、直接检出病毒核酸 　　1．核酸杂交（Nucleic acid hybridization） -临床病毒学中报速诊断方法通常是检测标本中的病毒抗原，然而核酸分子杂交具有高度敏感性和特异性，斑点杂交 (Dot hybridization) 广泛用于检测呼吸道标本，尿标本中的病毒核酸。标本滴加到硝酸纤维素膜上，病毒DNA结合到膜上，在原位进行硷变性处理后，有放射标记的已知病毒DNA片段杂并，两条单股核酸按硷基到补原则结合成双股，经放射自显影，阳性结果出现斑点状杂交信号。含轮状病毒的粪便标本经热变性处理，点到膜上，使用轮状病毒体外转录的放射标记探针做斑点杂交，敏感性高于ELISA。肠道病毒也可用互补的DNA探针做斑点杂交。 　　目前核酸分子杂交不但用来检测急性病人标本中的病毒DNA，也用于检测不易分离培养的慢

与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。 进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。 1. 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。 2. 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的 巴期德吸管中， 柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)－纤维素最大量为10mg总RNA，如果总RNA的量较少，则应减少oligo(dT)－纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。 3. 用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲

一、目的： 学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量的原理及技术。熟悉紫外分光光度计的基本原理与使用。 二、原理： DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700―7800。RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022―0.024。小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密

一、Feulgen氏染色法： 该方法是显示DNA的一种常用方法。其基本原理是在酸水解下，去DNA中的嘌呤，使脱氧核酸的醛基暴露出来，然后再与Schiff氏试剂反应，生成紫红色产物，用于显微分光光度计和流式细胞测量计对细胞进行静态DNA测量和流式细胞测量。 操作方式： （1）切片常规脱蜡至水。 （2）蒸馏水洗，1NHCI水溶稍洗。 （3）浸入1NHCI水溶液60℃，8-10分钟。 （4）取出后，1NHCI水溶液稍洗，蒸馏水洗数次。 （5）入Schiff氏液中室温下，暗环境30-90分钟。 （6）流水冲洗数分钟。 （7）常规脱水、封片。 结果：DNA呈紫红色。 注意事项： 1、1NHCL、Schiff液的配制方法见前。 2、该染色的优劣很关键。在于组织的固定。用甲醇85ml，福尔马林10ml，冰醋酸5ml配制的固定液效果很好。此外1

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。 寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA： 试剂试剂： 1、 3M醋酸钠（pH 5.2） 2、 0.1M NaOH 3、 1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量

mRNA的分离 与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。 进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。 1）用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。 2）将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片

基本概念 1）基因工程（genetic engineering）、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆。 2）克隆（clone）：无性繁殖——应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子（重组子），再通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子，进行扩增、提取获得大量同一DNA，或其表达产物。 基因克隆的基本步骤 1）连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子； 2）重组DNA分子转入受体细胞； 3）克隆载体在受体细胞中指导重组DNA分子复制； 4）外源基因随受体细胞分裂而得以复制、繁殖，并在受体细胞分裂时，重组DNA分子进入子细胞； 5）重组质粒的提取鉴定。 目的序列与载体的连接 1）粘性末端连接 （1）若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端

（一）概述 基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础，在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是：制备探针，标记探针，检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是：用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上（Dig-dUTP）。用随机引物及多聚酶，以探针为模板，合成互补，化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的化合物。 1、标记：本试剂盒采用随机引物标记方法，可标记少至1

核酸样品经过直接点样或转移到硝酸纤维膜上，固定后，可以进行杂交反应。在杂交溶液中，硝酸纤维膜上变性的核酸样品和变性后的探针在一定的条件下形成双链杂交核酸分子。然后进行酶标显色。 试剂及操作方法见本节　三。 五、真核细胞基因组的制备 从不同组织细胞或血细胞中提取是进行基因诊断的先决条件。制备的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持分子的完整。蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取的反应体系中，SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞 膜；（2）解聚细胞 中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使分子尽量完整地分离出来。具体方法如下： （一）白细胞的制备 （1）采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0

幼苗萌发 本研究采用国际麦类染色体制图动 议(ITMI)的小麦群体的亲本Opata、W-7984，种子在8格的长方形组培盘中进行，盘中放发芽纸(2.5×3cm)，每格10粒种子，加水。将培养盘置于25℃的黑暗条件下24小时，然后在温度为27℃、日长为16小时的条件让其发芽，时间为72小时。一套材料立即提取DNA，另一套材料放在具96格的培养盘中，贮藏在零下20℃条件下，不加缓冲液，贮藏30天后再提取DNA。 DNA提取 从三个幼苗上取1.5cm湿重为0.2g萌发的幼苗和胚芽鞘组织。将组织放在96格平底组培盘中，组培盘置于冰上，直接向每格的组织中加入 0.25M NaOH40µl。将盘在95℃水浴中1分钟。比较三种不同离析技术的优劣。采用手工方法 用研磨棒将96个样本研细。为了一次离析96个样本，采用了手动96针的重复因子。最后，用 Matrix Mill基质研磨器对组织进行机械离析，间隔时间为1、3、5、7、10分钟。培养 盘的每格中加入130µl 0.1M Tris-HCl，pH8.0。将培养盘在2250×g下离心10分钟。去掉150µl上清液后放在 0.2ml圆锥底

3 植物总DNA 的提取 1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分离了植物DNA，然而这些DNA 是不能用于克隆的。在发明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人们可用分离动物组织DNA 的方法分离植物DNA。去除植物带电高分子污染物的方法有核分离（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）分离（Murray，Thompson 1980）和盐酸／十二烷基肌氨酸钠分离（Sung，Slightom 1981）等。在这些方法中，CTAB 方法因简便、快速而使用最广泛。收集和保存植物组织的方法对于 DNA 的产量和质量也有很大影响。虽然已能成功地从植物标本和化石中分离出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鲜材料能产生最好的结果，特别是对于产生大量单宁、酚或其他次级代谢产物的种。如材料不能马上进行提取，应保存在冷而湿的地方，例如在冰

一、试剂： TNE ： 10mmol/L Tris cL (ph 8.0) 100 mmol/L NaCl 1 mmol/L EDTA 10%的SDS 酚、氯仿、乙醇 二、操作步骤： （1）收集鼠卵细胞，PBS 漂洗3次； （2）将细胞悬浮于500 ul的TNE缓冲液中； （3）加入6 ul20mg/ml蛋白酶K和50ul10%SDS，轻缓摇动； （4）37℃保存1-4小时； （5）加入等体积250ul饱和酚和氯仿，轻摇15-20分钟，1200rpm离心5分钟，用大口径吸管转移上清； （6）用2倍体积的乙醇（室温），轻摇至DNA出现； （7）12000rpm离心10 min，20ul TE溶解。 个人心得： 1. 卵细胞与一般的培养细胞系明显不同，收集卵细胞后一般都是在显微镜下计数细胞的个数，常常只有几十个或上百个细胞，所以裂解前

　　近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。 　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节　不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例

　　定位克隆（positoinal cloning），又称图位克隆（map-based clonig），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并单明其功能和疾病的生化机制。 　　定位克隆技术主要包括以下6个步骤： 　　1.筛选与目标基因连锁的分子标记。利用目标基因的近等基因系或分离群体分组分析法（BSA）进行连锁分析，筛选出目标基因所在局部区域的分子标记。 　　2.构建并筛选含有大插入片段的基因组文库。常用的载体有柯斯质粒（cosmid），酵母人工染色体