嵌合(杂合)病毒载体介导的基因转移 近几年发展起来的嵌合(杂合)病毒载体(chimeric or hybrid viral vectors)是基因治疗载体研究的一个重要方面，其中心思想是利用分子生物学技术把两种或两种以上的病毒载体结构组合起来，产生更优化的嵌合(杂合)病毒载体。下面简要介绍几种嵌合载体的研究情况。 (1)单纯疱疹病毒/腺相关病毒嵌合载体：在单纯疱疹病毒/腺相关病毒嵌合载体中，所使用的单纯疱疹病毒载体己去除了所有病毒基因，只保留了复制起始序列和病毒包装信号序列，并插入了腺相关病毒的rep基因和两端的ITR序列，目的基因则插在腺相关病毒的两个ITR之间。这样的载体既具有单纯疱疹病毒能够进入并定位于细胞核的特点，又具有腺相关病毒能够扩增外源基因并将其整合在人类非分裂细胞染色体特定位置的特点；同时，也克服了前者不兼容外源启动子的弱点，避免了后者包装容量低的不足。离体实验证明，受单纯疱疹病毒/腺相关病毒嵌合载体感染的分裂细胞经过一定时间的选择后，可以形成稳定表达目的基因的细胞克隆，且对细胞的毒性很小。 (2)腺病毒/腺相关病毒嵌合载体：这类载体是在第二代腺病毒载体的基础上插入了腺

细菌病毒―噬菌体介导的基因转移 噬菌体是能感染其他病毒或细菌细胞的病毒，体形微小，一般呈蝌蚪状。它们能侵入细菌体，在其中大量繁殖，使细菌细胞裂解。在噬菌体系统中，目的蛋白或多肽编码基因可融合在附加于噬菌体的外壳蛋白基因上。这些目的蛋白可连接在噬菌体的外壳蛋白的氨基端或者羧基端而展示在噬菌体颗粒的表面。 若目的蛋白是具有靶向性的配体或抗体，这些特异性蛋白在噬菌体的外壳上展示出来，便可与靶组织或细胞表面的受体或抗原结合，介导治疗基因靶向性传递。 某些细菌如减毒鼠伤寒沙门菌在小鼠体内能定向有效的转移自杀基因治疗肿瘤，说明细菌有望用作基因治疗载体。营养缺陷型菌株在全身给药时可富集于肿瘤组织，产生肿瘤靶向性。研究还表明细菌能将质粒呈递给不分裂的细胞，并在呈递基因后被宿主细胞杀灭。减毒鼠伤寒沙门菌作为肿瘤基因治疗载体，不仅能呈递外源基因，而且本身还有抑制肿瘤生长的作用。目前细菌作为基因治疗载体的实验都是在小鼠体内完成的，载体的效力和安全性还需要经过大量的实验研究予以证实。

治疗基因 基因治疗是指通过将遗传物质导人人体来治疗疾病的方法，应该导人什么样的遗传物质是基因治疗的另一个关键问题。选择遗传物质的基础基于人们对人类疾病分子病理机制的揭示和疾病相关基因的克隆，目前适合进行基因治疗的病种十分有限，很多病种目前还没有发现致病基因。基因治疗病种的扩大取决于新基因的发现和基因功能的阐明，只有在充分认识疾病相关基因结构与功能的前提下，才能有效地开展基因治疗。人类基因组计划及后基因组计划的进展和完成将揭示越来越多的人类疾病相关基因的结构和功能，因此，基因治疗是基因组计划研究的直接受益者。 根据Journal of Gene Medicine的统计，截至2006年，在全球1192项基因治疗临床试验方案中，常用的治疗基因可分以下几大类：细胞因子编码基因(312项，占26％)、抗原编码基因(189项，占16％)、肿瘤抑制基因(139项，占12％)、自杀基因(94项，占7．6％)，其他还有根据不同的遗传缺陷补充相应的缺陷基因、药物抗性基因、细胞生长复制抑制基因和受体基因等。 治疗基因通常是通过表达成蛋白质或多肽起作用，导人的是完整的有功能的基因；也可以直接以基因为靶标，导人

选择性转移治疗基因至靶细胞 通过修饰或改造基因传递载体，赋予载体与靶组织或靶器官选择性结合的能力，从而达到将治疗基因选择性转移到靶组织或靶器官的目的。如前所述，反转录病毒载体在感染靶细胞时，需要其外壳蛋白(Env)与细胞表面的受体相互识别，因此可以通过修饰env基因或Env蛋白来改变其感染能力或嗜性。例如采用能识别肿瘤细胞表面受体的配体或针对肿瘤特异性抗原的抗体基因取代env基因部分序列，使病毒表达能特异性识别肿瘤细胞的外壳蛋白，然后将病毒选择性带人靶组织或靶细胞，从而将目的基因靶向性地导入肿瘤细胞。Khare等将抗人癌胚抗原(CEA)单链抗体编码基因与env基因重组，使反转录病毒将“自杀基因”――一氧化氮合成酶(NOS)靶向导人CEA阳性的肿瘤细胞，并通过过度合成NOS杀死肿瘤细胞。靶向转移目的基因策略的工作原理 另一个例子是腺病毒。腺病毒载体在感染靶细胞时，首先依靠通过病毒衣壳(capsid)上的纤维蛋白(nber)头部的knob结构域识别并结合靶细胞表面的“柯萨奇病毒和腺病毒受体”(CAR)，然后通过衣壳的五邻体蛋白(pentom)与靶细胞表面的整合蛋白家族分子相互作用，内化进入

治疗基因表达的选择或靶向调控 理想的基因治疗不仅要求治疗基因能够高水平表达，还要求治疗基因能根据病变的性质和严重程度的不同、在靶组织或器官内以适当的水平或方式表达，因此，至少涉及空间、时间和表达量3个层次的调控。以肿瘤基因治疗为例，由于治疗基因通常是抑癌基因、自杀基因、新生血管形成抑制基因、细胞因子或免疫调控基因，这些基因在正常组织或细胞中表达时，不可避免会引起一定的毒副作用，因此，通常是将治疗基因直接导人肿瘤组织内；也有采用体外修饰的肿瘤细胞或免疫效应细胞回输，通过激发机体免疫反应治疗恶性肿瘤，此时，要求治疗特异性地针对肿瘤细胞，而不损伤正常细胞。为了达到这一目标，科研人员们进行了不懈努力，近年的研究方向主要集中在以下两个方面。 运用特定的基因表达调控元件，或借助于体内、体外的物理、化学诱导因素，使治疗基因特异地在靶细胞如肿瘤细胞中表达，是实现基因治疗可控或靶向性的又一重要手段。 许多肿瘤都有其自身特异性的标志，如肿瘤相关抗原。将治疗基因置于这类抗原的顺式调控元件(如启动子、增强子)的调控之下，可以使目的基因在相应的肿瘤细胞中获得高水平表达，而正常细胞由于缺乏与该顺式调控元件相互作用

与基因治疗有关的其他因素 基因治疗进入临床应用前必须首先进行动物实验，只有在动物实验中取得有效结果，才能用于临床试验。合适的动物模型对于基因治疗研究非常重要，没有合适的动物模型会影响到基因治疗的进展。例如，高胆固醇血症基因治疗的临床试验得益于一种患高脂血症的兔作为动物模型，血友病B狗为血友病B基因治疗提供了有益的动物模型。由于天然的遗传病动物模型有限，因而应采用基因打靶的方法将特定的基因剔除，人为造成基因的缺陷，制备各种遗传病模型。目前这方面的技术已经成熟，因而制备遗传病动物模型是基因治疗的临床研究的必要内容。 基因治疗是一个涉及基础研究与临床应用的跨学科工程。目前，多数临床试验项目都是由多家单位或企业合作进行的。不仅有基础与临床的合作，同时也有科研机构与企业的合作。多数用于临床试验的载体是由基础部门开发，然后由企业进行生产、制备后提供给临床的，从而使得基因治疗越来越接近或符合传统药物的生产制备与应用程序，也更趋于科学与合理。 对于遗传病的基因治疗，要求治疗基因长期、稳定表达。因此，外源DNA进入细胞核后，应设法整合在细胞的基因组中。对于人造的DNA颗粒而言这是一种低概率事件。如果要提

囊性纤维化的基因治疗研究进展 CF是一种白种人中最常见的致死性常染色体隐性遗传病，发病率以西欧、北欧及北美人群为高，约占活产婴儿的1/2000，在一些人群中甚至可以达到1/500，致病基因携带者高 CF患者因全身外分泌腺细胞分泌的黏液不能被及时清除，引起阻塞和感染，从而诱发各种临床表现：①慢性阻塞性肺部疾患，最终可因呼吸衰竭而死亡；②消化道受累，胰腺导管阻塞导致胰腺外分泌功能不全，少数胎儿还伴有肠梗阻；③汗腺受累，汗液中C1－、Na+浓度增高，甚至出现脱水性休克；④绝大多数男性患者输精管异常。CF患者中，98％死于肺部感染，其次为月于硬化、糖尿病等。 1985年，华裔科学家徐立致等运用连锁分析将CF位点精确定位于7号染色体长臂3区1～2带；1987年，徐立致等得到了CF致病基因的克隆，该基因编码一种穿膜导电调节蛋白(CFTR)。CFTR基因的克隆为CF基因治疗奠定了基础。目前CF是遗传病中基因治疗研究的热点，居遗传病临床试验方案的首位，达到18项以上。常以呼吸道上皮作为靶细胞开展基因治疗。第一个CF基因治疗方案于1993年4月16日得到终审许可，次日1名23岁的男性CF晚期患者成为接受

血友病B的基因治疗 血友病B基因治疗的实施也得益于凝血因子Ⅸ基因的克隆。血友病(hemophilias)是一组古老的遗传性出血性疾病，血友病B(乙型血友病，又称凝血因子Ⅸ缺乏症)表现为自发性出血，严重者危及生命。临床治疗血友病主要依靠蛋白质替代治疗，即输血或注射凝血酶原复合物等。但可能引发严重的输血反应、血栓形成和栓塞等，尤其严重的是患者面临艾滋病病毒及肝炎病毒感染的威胁，发生率可达50％。 1982年，英国牛津大学的Brownlee课题组和美国密歇根大学Kurauch课题组等相继克隆了hFIX cDNA及基因组DNA。1992年以来基因重组的FVⅢ和FIX相继进入临床试验或临床应用，为血友病患者的治疗带来了福音。但是重组的凝血因子并不能改变患者反复注射、终身用药的问题，不能够从根本上治疗血友病。 血友病的生理、生物化学和遗传特征决定了血友病是基因治疗研究的理想病种，特别是血友病B基因治疗是早期基因治疗探索最为理想的病种之一。中国和美国分别于1991年和1999年开展了血友病B基因治疗临床试验，证明不仅安全，而且有效。

肿瘤基因治疗临床试验最常用的几种策略(2)(五)阻断肿瘤生长相关基因表达 肿瘤的生长与肿瘤微环境或肿瘤细胞内生长相关基因的过度表达关系密切，阻断与肿瘤生长相关基因的表达可有效抑制肿瘤生长。反义基因治疗是目前肿瘤基因治疗的一个重要方面，采用反义技术在基因转录和翻译水平阻断肿瘤生长相关基因的表达，所涉及的主要是细胞周期中正调控基因，包括一些激活的原癌基因和肿瘤的自分泌生长因子及其受体。通过反义治疗可以阻断肿瘤的生长，达到治疗效果。近年来在离体实验和动物试验中取得较好的结果，特别是神经胶质瘤IGF―1及其受体的反义基因治疗取得了可喜的进展，这方面的研究已经进入了临床试验。(六)发挥抑癌基因的作用 肿瘤的形成机制涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活，原癌基因对细胞的生长起正调节作用，而抑癌基因又称抗癌基因，对细胞的生长起负调控作用。原癌基因和抑癌基因在细胞内是一组相互抗衡的力量，此消彼长。抑癌基因的各种突变和缺失会引起癌基因的激活，导致细胞持续生长而形成肿瘤。因此，人们希望利用抑癌基因的转移使肿瘤细胞的生长受到抑制、细胞表型恢复正常或引起细胞凋亡。Rb和p53基因是最早发现的抑癌基因。Rb基因缺

遗传临基因治疗研究进展 遗传性疾病是指由人体内的遗传物质即DNA发生了改变所致并可传递给后代的一类疾病。遗传性疾病主要分为3大类：①单基因病；②染色体异常；③多基因病。 目前已经发现的人类单基因病达4 000种以上。单基因病以孟德尔式遗传方式传递给后代，所以又称为孟德尔疾病(Mendeliandisorder)。大多数单基因病非常少见，如果将所有的单基因病统统累加起来，约占整个人群疾病的1％。 染色体异常的发生率更低，约占0．6％。大约60％的早期自发性流产胎儿都伴有染色体畸变，肿瘤和白血病常常伴有细胞染色体的改变。 多基因病是由多个基因与环境因子共同作用所引起的。这类疾病非常广泛，发病率高，严重危害人类健康，如高血压、糖尿病、哮喘等。 经典的遗传病在治疗上可采用下列6种方法：①激素替代；②食物限制；③蛋白质替代；④细胞或器官移植；⑤药物治疗；⑥手术治疗。这些方法均存在缺陷或不足，难以从根本上治疗遗传病。 基因治疗在理论上是根治遗传病的唯一方法。目前基因治疗研究已经广泛深入到遗传病、肿瘤和病毒性疾病，并且取得了一定的成功，成为生命利，学领域里的一个研究热点。 然而，由于受多种因素的限制

肿瘤基因治疗的新策略 腺病毒是肿瘤基因治疗常用的载体，过去出于安全的考虑大多采用复制缺陷型腺病毒，但复制缺陷型腺病毒的作用仅仅是介导外源基因高效导人肿瘤细胞的载体。由于腺病毒在感染细胞中能诱发细胞凋亡，因此人们试图研制出能在肿瘤细胞中选择性扩增，最终诱导细胞凋亡的腺病毒，既保证基因治疗的安全性，又能在肿瘤组织中复制，从而增强杀伤肿瘤的效果。1996年，ONYX医药公司的Bischoff等人研制成功了一种可在p53突变的癌细胞中选择性复制并裂解肿瘤细胞的腺病毒。目前该病毒已应用于临床试验，在32例头、颈癌患者中，ONYX―015病毒未发生任何毒副作用，12例病人可见肿瘤体积明显缩小，个别病人肿块缩小90％。在中国，以该病毒为基础的新病毒已被批准进入临床试验。 与普通复制缺陷型腺病毒相比，肿瘤选择性复制型腺病毒应用于肿瘤基因治疗具有明显的优势，表现在病毒的扩增、纯化将更加简便；病毒在肿瘤细胞内大量复制，不仅裂解细胞，还可释放大量子代病毒，并继续感染周围的其他肿瘤细胞。因此，病毒对肿瘤细胞的感染效率大大提高。如果在复制型腺病毒基因组中再克隆合适的外源基因，可明显提高外源基因的拷贝数和表达效率

组织工程的概念和原理 组织工程学(tissue engineering)是根据细胞生物学和工程学的原理，将具有特定生物学活性的组织细胞与生物材料相结合，在体外或体内构建组织和器官，以维持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能的一门科学。组织工程技术的基本原理，是将组织细胞(或者干细胞)贴附于生物相容性良好的生物材料上，形成细胞―生物材料复合物；将其植入到体内特定部位，或者置于体外特定环境下，在生物材料逐步降解的同时，细胞产生基质，形成新的具有特定形态结构及功能的相应组织。 组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。细胞通过大量分泌胞外基质完成组织结构的架构，细胞在新组织内的生物学活动维持了组织结构的长期稳定，并使再生组织具有特定的生理功能。生物材料为细胞提供了适合其生长、基质合成及发挥其功能的生物学空间，克服了以往单一的细胞移植中细胞不易成活、基质合成能力低下等缺点。生物材料支架降解前为三维组织形成提供了临时的机械支撑，同时也是未来所构建组织与器官的三维形态模板。细胞与生物材料之间的相互作用是组织形成即组织工程化组织构建的关键，生物材料上细胞接种必须保持一定的高密度，生物

干细胸的基本概念 干细胞是广泛存在于动物和人发育各阶段的保持未分化状态的一类较原始的细胞。生物个体的发育、组织的再生以及创伤的修复都与干细胞有着密不可分的关系。与成熟的体细胞不同，干细胞能够进行自我更新(self―renewing)及向与自身来源相似或不同的细胞类型分化(differentiation)，形成特定类型的细胞及组织。由于能够自我更新，干细胞能够形成与之完全相同的子代干细胞，从而在一定程度上维持了干细胞群体数量的稳定性；同时，干细胞又保持了分化的特征，能够在特定条件下启动分化程序，产生适应于不同功能要求、存在于不同体液微环境中的特定子代细胞，从而在机体发育、修复及环境适应等方面发挥积极作用。 什么是干细胞?这个问题争论了30余年。目前的观念认为，干细胞是具有无限或持续自我更新能力、产生至少一种高度分化的子代细胞的细胞群。通常，介于干细胞与终末分化的子代细胞之间，尚存在一种中间状态的细胞群体，即具有有限增殖能力及分化潜能的定向祖细胞，如众所周知的瞬时扩增细胞(transient amplifying cells，TA细胞)。对于只有单一分化方向的干细胞，如表皮干细胞，这些TA

寻找组织工程的理想种子细胞 组织工程技术是应用细胞生物学和工程学的原理，将细胞在体外培养扩增后，接种至可降解的生物材料上，形成细胞-材料复合物，随着材料的逐步降解，细胞分泌细胞外基质，细胞就逐渐形成了相应的组织。将这种工程化的组织植入到缺损部位，可以修复和改善损伤组织的结构与功能，形成有活力的正常组织和器官，达到真正意义上的生物学重建。基于以上原理，种子细胞和生物材料将是组织工程技术的两大关键要素，其中种子细胞为核心。 从理论上讲，最理想的组织工程种子细胞是携带全部基因组型的自体细胞，目前只能是自体组织细胞。例如，来自关节软骨的自体软骨细胞可在体外进行分离、培养、扩增，分泌软骨基质，并可作为组织工程技术的种子细胞，在体内重新构建出组织工程化的软骨组织。应用软骨细胞为种子细胞在体内外已经能够成功地构建出精确形状的软骨组织；植入到软骨全层缺损内，可以产生良好的透明软骨修复。但是，软骨细胞体外扩增能力极为有限，且易发生老化，多次传代后即丧失软骨形成能力。研究者虽然探索了诸多防止软骨细胞老化的方法与技术，但都因技术操作繁复或费用过于昂贵而难以真正得到应用。 同种异体及异种软骨细胞由于来源不受限

制备纳米粒的常用的聚合物 1．聚乳酸(PLA) PLA是由乳酸脱水聚合成丙交酯，再由丙交酯开环聚合而成。PLA是一种无毒，有较好生物兼容性的可生物降解材料，能在体内先降解成人体代谢的产物――乳酸，然后进一步分解成二氧化碳和水。PLA的亲水性和结晶度都比较低。因乳酸是手性分子，导致PLA有4种形态，即L―PLA、D―PLA、D，I―PLA以及Illeso―PLA。L―PLA、D―PLA是高结晶度聚合物，降解时间较长，主要归因于较高的结晶度阻止了外部的水渗入聚合物中。而D，L―PLA具有较小的结晶度，是一种完全无定形的共聚物，常用作药物控释载体。meso―PLA不常使用。由于I―PLA的降解产物L―乳酸能被人体完全代谢，因此它具有无毒、无组织反应的特殊优点，更具竞争力。 2．聚己内酯(PCL) 起初人们只认识到PCL能被微生物降解，故大量作为包装材料使用，后来发现PCL在生理条件下也能水解，因而引发出其在医学领域的应用。与PGA和PLA比较，PCL因结晶性太强而导致降解速率要慢得多，因此PCL更适合作为长效植入药物的控释载体。 3．聚乙二醇(PEG) PEG是最常用的亲水性聚合物，其相对分

纳米粒的表面改性 表面改性赋予纳米粒表面以亲水性，以减少肝脏巨噬细胞吞噬，延长体循环的时间，增加对细胞膜的黏附能力等。 在很多注射型载药系统中存在一个很大的问题，即这类药物能被人体的单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system，MPS)很快地从血液中清除。微粒的大小和表面特征是决定清除速度的关键性因素。由于有充足的血液供应、特殊化的血管结构和丰富的MPS细胞，大多数直径小于5 gm的颗粒会被清除到肝脏和脾脏的巨噬细胞。早期抑制MPS清除作用的策略之一是“喂食”过量的零负载的纳米粒，如聚苯乙烯纳米粒和脂质体等，或者使用吞噬抑制剂(phagocyteosis depressants)，如硫酸右旋糖酐(dextran sulphate)、棕榈酸甲酯(methyl palmitate)、氯化钆等。但是，这些方法通常会损害MPS功能，从而增加了人体对疾病的易感性。另外一些可能的方法包括改变纳米粒的大小、表面电荷以及亲水或疏水的性质。 随后的研究发现，采用亲水的非离子性高分子改性试剂包裹纳米粒表面，可以很大程度地增加它们在血液循环中的稳定性。这些高分子材料必须是惰性的

纳米粒靶向药物的传输和释放一、靶向传输 表面改性纳米粒另一个激动人心的应用是针对肿瘤和器官的靶向药物传输。如上所述，纳米粒在体内有长循环、隐性和立体稳定等特点。这些特点均有利于药物的靶向，是抗肿瘤药物、抗寄生虫药物的良好载体。 Kreuter等人利用聚山梨醇酯―80改性后的聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒负载多种药物，使其成功地穿过血脑屏障。他们认为，改性后的纳米粒注入血液后，载脂蛋白E(apolipoproteinE)被吸附在纳米粒的外表。载脂蛋白E和低密度脂蛋白十分相似，利用这种相似性，纳米粒被大脑中低密度脂蛋白受体输运到大脑内部。 纳米粒药物传输系统相对于传统的药物传输系统的优势还体现在另外一些具体的领域，其中之一是动脉血管手术后再狭窄(restenosis)的预防。血管的再狭窄是动脉手术后所面临的主要难题之一。为了防止血管平滑肌细胞增生，药物必须能在较长时间内以较高的浓度传输。利用纳米粒传输药物的优点在于不需要很大的剂量，因为纳米粒体积很小而可以轻而易举地进入细胞内部或穿过结缔组织。一些药物包括生长抑制剂(antiproliferative agents)被用来测试这种传输方式。采用可

蛋白质工程与新药开发 1978年，美国Hutchison使用了Lederberg于1960年推荐使用寡脱氧核糖核苷酸作为体外诱变剂，成功地实现了定位突变(site-directedmutagenesis)试验，培育出了多种具有生物学特性的突变株。1981年，美国Genen公司厄尔默(Ulmer)则将此定位突变试验冠以“蛋白质工程”。蛋白质工程的定义是：通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究获取关于蛋白质物理、化学等方面的信息，在此基础上对编码该蛋白质的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：①根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；②确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 蛋白质工程

蛋白质的分子结构 蛋白质分子的结构有4个严格的层次，即蛋白质的一级至四级结构。 蛋白质的一级结构(primary structure)是指多肽链的氨基酸残基的排列顺序。胰岛素的一级结构 线性的多肽链在空间中折叠成特定的三维空间结构，称为蛋白质的空间结构或构象。蛋白质的空间结构包括二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构。 蛋白质二级结构(secondarystructure)是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间结构(构象)，主要有α-螺旋、β-折叠、转角等几种形式。α-螺旋 β-折叠 超二级结构(supersecondarystructure)和结构域(domain)是介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构。超二级结构是指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件(blockbuilding)。其基本形式有αα、βαβ和即βββ等。结构域是在超二级结构的基础上形成的，通常由50～300个氨基酸残基组成。其特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的

蛋白质结构的测定(一)蛋白质一级结构的测定 蛋白质一级结构的测定又称蛋白质序列分析。其基本方法是：①应用化学裂解法和蛋白酶水解法将多肽链专一性裂解；②逐一测定每个纯化小肽段序列；③根据肽段氨基酸序列中的重叠区确定小肽段的排列次序；④完成整条多肽链的序列分析。 尽管蛋白质序列分析已经自动化，但仍然耗时、复杂并且昂贵。重组DNA技术出现后，人们可以从cDNA或基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸序列，速度快且经济，已成为最常用的测定蛋白质一级结构的方法。(二)蛋白质三维结构测定 根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类：①应用X线晶体衍射图谱法(X-ray crystallography)和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象(图14-6)；②应用核磁共振法(nuclear magnetic resonance，NMR)、圆二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。X线晶体衍射的基本原理 1．X线晶体衍射图谱法 利用X线晶体衍射图谱法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。