二维凝胶电泳质谱技术等电聚焦电泳 1. IPG的pH值范围 等电聚焦电泳 (isoelectrofocusing，IEF)目前广泛使用商品化的IPG胶条。其pH值范围的选择一般遵循以下原则：①pH 3一10线性梯度胶适于了解样本中所有蛋白质的分布情况；②pH 3―10非线性梯度胶能提高pH 5―7之间的样本蛋白质解析度；③联合使用pH 4～7和pH 6～11梯度胶可获得相关pH范围的更清晰的蛋白质分布情况；④小pH范围梯度胶(如pH 3．5―4．5，pH 4．5―5．5，pH 5―6等)可提供高分辨率的蛋白质分布图谱。 2．IPG系统主要的蛋白质上样方式 (1)泡涨上样：可以允许低浓度样品上样，有较大的上样量。但因需要泡涨过夜，故蛋白质可能发生溶解或修饰。 (2)杯上样：容易在上样处形成蛋白质沉淀，蛋白质样品易渗漏。但对于pH 6～1l和pH 6～9的碱性胶条可以得到更好的分离效果。 上样重泡涨液一般为相应的提取液+相应的两性电解质(o．5％)+痕量溴酚蓝。 3．胶条水化时间和等

蛋白质组学与医学研究 蛋白质组研究技术已应用到生命科学各个领域。在基础研究方面如生物学、神经生物学等，涉及各种重要的生物学现象，如信号传导、细胞分化、蛋白质折叠等。在应用研究方面，蛋白质组学重点研究人类重大疾病的发病机制、早期诊断及治疗，致病微生物的致病机制、耐药性及发现新的抗生素等。此处所指的人类重大疾病包括癌症(肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肺癌、直肠癌等)、心血管疾病(心肌梗死、冠心病等)、妊娠病理(妊娠期高血压、妊娠期肝内胆汁淤积等)、神经病理、传染病(乙型肝炎等)。(一)肿瘤 蛋白组学用于肿瘤研究，旨在研究蛋白质差异表达，建立蛋白质表达数据库；筛选肿瘤标记蛋白，确立早期诊断标志物，确定肿瘤治疗靶标。目前对人类多种肿瘤(包括肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肺癌、大肠癌等)的研究均取得一定进展。 国内宋海燕等对有无转移的肝细胞性肝癌(HCC)组织进行二维凝胶电泳和质谱分析，发现16个蛋白质表达有差异，包括S100钙结合蛋白(S100)、热休克蛋白27(HSP27)、细胞角蛋白18(CKl8)等，其中HSP27在转移性HCC中高表达，提示HCC转移与多种蛋白表达相关，HSP27高表达

loxP转基因动物的构建 loxP转基因动物是在基因组中待修饰基因区域的两侧各插入了1个loxP位点的转基因动物。该转基因动物的构建首先需要一种特殊的载体，这种载体主要由3个部分组成：①分别存在于打靶载体5，和3’臂端，是与靶基因一定区域相同的同源序列，其作用是介导打靶载体与靶基因之间的同源重组。②位于5’和3’臂端之间有待敲除的靶基因区段序列或有待敲人的外源序列和选择标志基因。选择标志基因一般为neo―2A基因，含有两个选择标志：一个为G418抗性基因(neo)，为细胞提供针对G418的抗性，为正筛选标记；另一个为胸腺嘧啶激酶基因(tk)，可以把培养基中的更昔洛韦(ganciclovir)磷酸化为对细胞有毒的化合物，为细胞提供负筛选标记。③3个loxP位点，分别位于待敲除靶基因同源序列的两侧和选择标志基因的两侧。 一般采用线性化的打靶载体来转染胚胎干细胞，常选用位于同源序列边缘或之外的限制性内切酶作用位点作为打靶载体线性化的切点。取代型打靶载体整合进基因组的结果是靶载体中的序列置换掉基因组中的同源序列。 loxP转基因动物的构建一般采用胚胎干细胞基因转移法。在这个过程中，首先要构建具

条件性基因敲除应用于研究基因的 功能 层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质中的一个重要成分，在调节细胞的生长和功能方面发挥重要的作用。层粘连蛋白是一个异源三聚体，由α、β和γ亚基构成。之前的研究表明，层粘连蛋白功能的缺陷可以导致肌肉营养失调和外周神经髓鞘形成障碍。全身性层粘连蛋白基因的缺失可以导致胚胎在胚胎发育第5天即发生死亡，因此用传统的基因缺失方法无法研究层粘连蛋白基因在外周神经系统中所发挥的功能。陈祖林等为了研究层粘连蛋白在外周神经系统中的作用，采用Cre―loxP系统在神经膜细胞中对层粘连蛋白进行条件性敲除。具体的研究方案如下：在层粘连蛋白γ1第1个内含子和第2个内含子中分别插入一个loxP位点，同时在第1个内含子中还插入一个neoR 基因作为筛选标记，并且在neoR 两侧各含有一个flp位点，用于去除neoR 基因，以避免neoR 基因序列的存在可能对小鼠造成的影响。在Cre转基因小鼠中，Cre重组酶被置于基因户。的启动子调控之下，使Cre特异性地只在神经膜细胞中表达，而在其他组织和细胞中不表达。这两只小鼠杂交后所产生的双转基因小鼠中，实现了层粘

致病基因的条件性敲入，构律人类某些疾病的动物模型 利用Cre／loxP系统进行条件性基因 敲人的原理与基因敲除的原理非常相似，区别只是在事先想要研究的基因编码区内引入一段翻译终止序列，并且该终止序列的两侧具有两个同向的loxP位点。在没有Cre重组酶的组织和器官中，由于翻译终止序列存在致病基因是没有活性的，在某些特定的组织器官中，当Cre重组酶出现时会导致终止序列的丢失，从而使致病基因激活，这样就实现了致病基因在某些特定组织和器官中的条件性敲人。 AML―ETO是一个融合蛋白，在急性粒细胞白血病的发生中具有重要意义，但是采用普通的转基因手段使小鼠表达该基因后会严重影响正常的造血功能，因此会导致小鼠胚胎发生宫内死亡。Masakazu等采用条件性基因敲人方法研究了该基因在急性粒细胞白血病的发生中所发挥的作用，克服了上面所提到的问题，取得了比较理想的结果。他们首先用两个loxP位点之间的转录终止序列分割AML―ETO的编码基因，从而使该基因在没有Cre的情况下处于非活化状态。该转基因小鼠与Mxl―Cre转基因鼠进行交配产生的子代小鼠同时含有这两

条件性基因敲除应用于追踪细胞的发育命运 在胚胎 发育过程中，特定器官的出现以及特定类型细胞的分化是按照细胞内的程序有条不紊地进行的，研究这些细胞的分化及迁移，对于阐明个体的发生过程、探讨某些疾病的发生机制非常重要。在研究过程中，一般会选择一种或多种特定细胞的分子标志来标记相应细胞的分化、运动以及形态的变化。但是检测这些分子标志的一般方法如RT-PCR或原位杂交等不能提供连续、动态的报告，而基因敲人手段可以克服上述问题。具体方案如下：将报告基因如lacZ的编码区用一个终止序列隔开，终止序列的两端具有两个loxP位点，由于终止序列和loxP位点的存在，lacZ不能翻译出具有活性的蛋白质，含有这样一个基因片段的转基因小鼠其体内的lacZ是没有功能的，因此体内的细胞不能被X-gal所染色。只有在Cre重组酶存在的情况下，终止信号消失并将lacZ基因活化后，它们才能被X-gal所着色。这样就可以通过控制Cre重组酶在所感兴趣的细胞内的表达来控制相应细胞能否被X-gal所着色，从而对这些细胞的发育或迁移途径进行连续的动态的观察。 Novak等构建了一

基因敲除到总结和展望 经典的基因 敲除将靶基因在所有的组织器官中终生灭活，这就导致许多在成体器官发育中具有重要功能的基因，如肿瘤抑制基因Brcal、Brca2、Dpc4/Smad4等，在敲除后引起小鼠胚胎早期死亡，使得研究者无法深人探索这些基因在成体中的重要作用。因此可以在特定的时间和空间即在特定的发育阶段和特定的组织细胞中开启或关闭特定基因的时空特异性基因打靶(spatio temporal gene targeting，STGT)技术应运而生。Cre/10xP和FLP-FRT系统的应用使得组织特异性基因敲除变为现实，应用这两个系统，研究者可以如愿以偿地在不同的时相、不同的空间按预期的设计进行基因敲除。这两个系统的如下优点极大地扩展了它们在后基因组时代的应用：①时间和空间特异性，从理论上来说，利用该策略可在任何发育阶段对任何组织细胞中的任何基因进行突变改造；②可对靶基因进行缺失、插入、倒位和易位等多种形式的突变；③在发生缺失突变时，除1个loxP位点外，无任何非期望的外源基因或DNA序列残留于基因组中。所以，随着该技术的进一步发展和完善，相信它会在基因的功

肽库的概念和分类 肽库 (peptidelibraries)是大量特定长度且序列不同的小肽的集合，它包括了该长度短肽中各种(或绝大部分)氨基酸序列的排列组合。 肽库最早是Geyson及其同事在1986年提出的，他们认为：①蛋白质分子之间的结合或识别主要是由局部肽段上数个氨基酸残基间的相互作用来完成的，这些氨基酸之间形成非共价键联系；②有些多肽虽然其序列与抗原的天然表位不同，但在结合抗体或配体时的方式是相同的，因此这种具有关键氨基酸残基的多肽称为模拟表位(mimotope)。模拟表位的概念在随机肽库的发展过程中起到了重要的推动作用。所谓肽库筛选就是获得这些具有特定结合功能的多肽，以替代大分子的蛋白质。 肽库根据其构建的方式不同，可分为天然肽库和合成肽库两大类，而合成肽库又可依据构建的原理不同可分为化学合成肽库和生物合成肽库。 (一)天然肽库 天然肽库(naturalpeptidelibrary)是采用化学降解方法或蛋白酶水解方法对天然蛋白质进行处理后产生的。化学降解方法如采用溴化氰(CNBr)作用于蛋白质上的Me

噬菌怖肽库技术的发展历史 1982年，Dulbecco首先提出一种创造性的设想，他认为可以将病原体的抗原与入噬菌体或其他病毒的衣壳蛋白融合并表达在其表面，这种表面表达有病原体抗原的病毒颗粒可以作为疫苗，由此第一个提出了表面展示(display)的概念并申请了美国专利。1985年，Smith首次证实了丝状噬菌体fd基因组可以通过基因工程技术进行这种改造，他将EcoRI核酸内切酶的部分基因片段(171bp和132bp)与噬菌体衣壳蛋白的编码基因声Ⅲ融合，并成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体，获得的重组噬菌体可在体外增殖，而且与pⅢ融合表达的内切酶能被抗EcoR工内切酶抗体所识别，并建立了亲和筛选的概念。实验表明，展示在噬菌体外壳表面的酶分子与天然酶有着相同或极为相近的构象和活性，由此诞生了噬菌体表面展示技术。1988年，Parmley等将已知的抗原表位与基因pⅢ的N端融合并展示于噬菌体表面，用相应抗体可将其特异性地筛选出来，并通过测定其DNA序列就可以知道插入肽段的氨基酸序列，该技术将展示肽的表型与基因型直接联系起来了。Parmley提出的设想就是

噬菌怖肽库技术用于分析蛋白质的抗原表位 蛋白质 的抗原表位即该蛋白质在参与抗原-抗体反应中直接与特异性抗体结合的氨基酸序列和构象。研究蛋白质的抗原表位对于了解蛋白质的结构与功能、分子识别的基础是十分重要的，也为多肽药物的筛选、疾病新型诊断抗原以及多肽疫苗的研制提供重要的依据和线索。 目前广泛用于蛋白质抗原表位的分析方法主要是肽扫描，即按照蛋白质氨基酸的序列，合成多个线形的重叠肽，再利用抗体筛选能与之发生反应的片段，然后通过氨基酸突变分析法，逐个进行氨基酸的突变，以确定起主要作用的关键氨基酸。但这种方法存在着几方面的缺陷：工作量大，工作效率低；合成肽的成本高；更主要的是必须先确定该蛋白质的完整氨基酸序列。但实际上，序列完全清楚的蛋白质是有限的，因此也限制了该方法的应用范围。另外，大多数蛋白质其抗原表位90％是构象型表位，仅lo％为线性抗原表位。而合成的序列肽一般是模拟蛋白质的线性表位，这就可能会失去大多数的构象型表位信息。而利用噬菌体随机肽库技术就可以弥补这些分析方法的不足。 噬菌体肽库技术既可以筛选出与原始抗原完全相同

噬菌怖肽库技术用于发展新型诊断抗原和疫苗 噬菌体肽库 技术可以用于筛选疾病特异性抗原表位，在疾病的诊断、治疗以及新型疫苗的研制方面具有广泛的应用前景。感染或曾经感染过某种病原体的患者，其血清中往往存在有相应的病原体特异性抗体，临床上可以通过检测这些抗体来知道患者感染的状况。常规检测这些抗体的方法需要有诊断抗原，而这些抗原通常是纯化的病原体天然抗原或者是通过基因工程技术表达和纯化的重组抗原。但如果在病原体未知或者抗原不容易获得的情况下，上述方法就很难发挥作用。但通过噬菌体随机肽库技术却仍然能够获得病原体的抗原表位，往往是模拟表位。这种模拟表位也为疫苗的研究提供了一条崭新而有效的途径。 De la Cruz于1988年首先证明了噬菌体可以作为外源多肽的免疫载体；1994年，Motti等用抗HBsAg单克隆抗体从随机15-肽库中筛选到了HBV病毒的特异性模拟表位；同年，Folgori等首次直接利用人HBsAg免疫后的抗血清对随机9-肽库进行筛选，并用正常人血清进行反相吸收，也获得了病毒的模拟表位，而且这种模拟表位可以与病人血清发生特异性免疫反应

噬菌怖肽库技术在新型药物设计中的应用 传统药物 的开发一般是从自然界的动物、植物和微生物中分离出具有特定药理作用的化学物质或蛋白质(多肽)，然后对于化学物质(一般是作为药物研究的先导化合物)再经过进一步的设计、改造及合成有效的功能药物；而对于蛋白质(多肽)，则一般通过基因工程手段进行改造发展成基因工程药物。目前大部分药物是通过这些方法获得的，但此方法往往周期长、风险高、耗资巨大，并带有很大的盲目性。而从噬菌体肽库中，通过亲和筛选的方法，可以得到具有特定生物活性的多肽如酶抑制剂、抗菌肽等，作为新型药物或先导药物。 利用噬菌体肽库技术筛选药物的主要依据是：任何药物都是通过受体发挥作用的，这就需要药物与受体发生特异性结合，而受体一般都是蛋白质或核酸，这种相互结合的位点就为药物筛选与设计提供丁科学依据，避免盲目性。 1．酶抑制剂 噬菌体肽库技术是寻找蛋白酶抑制性多肽的理想工具。蛋白酶的作用位点或别构效应的调节位点往往位于空间结构上的裂缝中，通过这些裂缝蛋白酶可以与其底物发生特异性结合，从而发挥酶活性。而抑制剂通常也是与这些裂缝结合

噬菌体肽库技术的原理 噬菌体肽库技术实际上是通过噬菌体展示技术将一定长度的所有外源多肽展示于噬菌体载体表面，实现基因表达产物与亲和筛选相结合的一种技术。以噬菌体为载体，把一段特定长度、随机合成的基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质(如pⅢ和pⅧ)N端的编码基因中，使这段基因编码的相应外源多肽在噬菌体外壳蛋白的N端以融合蛋白的方式表达并展示于噬菌体颗粒的表面，而且这种插入的外源多肽不影响和于扰噬菌体的生活周期，同时能够保持其天然构象，可以被相应的抗体或受体等靶分子所识别。同时，由于这段特定长度的基因是随机合成的，从理论上讲这段基因所编码的相应多肽应该包含自然界中这个长度肽的所有序列，这样就构成了一个特定长度的多肽库，而且库容量极大。进而可以利用靶分子，通过适当的亲和富集即生物淘选(biopanning)方法即“亲和吸附一洗脱一回收一扩增”多轮亲和筛选富集过程，洗去未吸附的或非特异结合的噬菌体，就可以从这个肽库中筛选到与靶分子特异性结合、表达有目的肽的噬菌体，经过感染大肠杆菌后可以大量扩增。另外，外源多肽展示在噬菌体的表面，但其编码基因位于病毒单链基因中，可通过对噬菌体的DNA测序推导出来，因

噬菌体表面展示方式 目前在噬菌体肽库技术中，主要用于表面展示肽库的方式有两种：pⅢ蛋白展示方式和pⅧ蛋白展示方式。展示系统又可分为噬菌体表面展示系统和噬菌粒(phagmid)表面展示系统。 噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可展示外源多肽或蛋白质，在基因工程操作上基本相同：在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有一个可以插入外源基因片段的克隆位点，插入的外源基因编码的蛋白与pⅢ和pⅧ以融合蛋白的形式表达并分泌至胞间质内，当宿主蛋白酶切除信号肽后，融合蛋白则成熟组装并包裹病毒DNA分子形成病毒粒子的外壳。 1．pⅢ蛋白展示方式 丝状噬菌体的pⅢ蛋白是一种次要外壳蛋白，由基因gⅢ编码，位于丝状噬菌体的头部，在每个噬菌体颗粒表面仅有3～5个拷贝，具有识别和吸附大肠杆菌性菌毛的功能，是噬菌体感染宿主必不可少的部分。 pⅢ蛋白是噬菌体外壳蛋白中相对分子质量最大的蛋白质，pⅢ前体由424个氨基酸残基组成，相对分子质量为44 651X10‘，其中信号肽由18个氨基酸残基组成(MKKLLFAIPLVVPFYSHS)，引导pⅢ至细菌胞间质后即被

噬菌体表面展示系统 1．噬茵体展示系统 噬菌体展示系统是在野生性丝状噬菌体的基因组基础上改造而成，保留了噬菌体完成整个生活史所必需的基因，包括感染宿主、DNA复制、包装蛋白质合成以及病毒组装的基因，还包含一个抗生素的遗传标记和一个多克隆限制性酶切位点。 噬菌体载体不需要辅助噬菌体，比较稳定。但由于DNA基因组大(相对分子质量为9 000～10 000)，回收DNA的产量低，也较困难，插入片段大时(超过6个氨基酸)会影响噬菌体的感染性。 2．噬菌 粒展示系统 噬菌粒(phagemid)是噬菌体和质粒的混合体，一般是在大肠杆菌表达的质粒载体中引人丝状噬菌体的colEl复制起点、单链DNA合成和包装信号的全部顺式作用元件，以及噬菌体完整的gⅢ或gⅧ基因。当该质粒转化大肠杆菌时，能够以单链DNA的形式包裹在噬菌体的衣壳之中，这种以单链DNA形式被包装在噬菌体衣壳中的质粒称为噬菌粒。在这种系统中，当将外源基因融合在完整基因gⅢ或gⅧ的N端区域时，外源多肽便与噬菌粒载体的衣壳蛋白融合表达在噬

噬菌体肽库技术的特点 (1)在噬菌体 表面展示的融合蛋白或肽直接有效地与其编码基因密切偶联在一起，因而在获得多肽的同时通过对噬菌体单链DNA插入DNA进行测序，从而得到了多肽的编码基因。 (2)库容量大(目前可达到1010 )，选择范围广泛，可能筛选到针对某个生物大分子的新型特异性结合肽，甚至是自然界中不能天然产生的但具有高亲和力的配体分子。而且筛选到的多肽结构多样，为进一步分析研究蛋白质结构与功能提供了大量有用的信息。 (3)筛选过程具有高效、快速等特点，是一种简单的高通量筛选模式，为迅速找到生物大分子的特异性强、亲和力高的结合多肽提供了可能。 (4)噬菌体肽分离、纯化步骤简单，有利于大规模生产，而且试剂常规，价格低廉。目前常用丝状噬菌体在大肠杆菌中扩增时，噬菌体是以出芽的形式释放的，不裂解宿主，这样培养上清液中没有宿主细胞的蛋白质污染，方便噬菌体的分离和纯化过程，只需用PEG一步沉淀就可完成。 (5)缺点：库容多样性易受到多种因素的影响，且获得的是小分子肽亲和力较低；基因表达

噬菌体肽库到构建方法 利用噬菌体展示技术建立随机肽库的方法是：通过化学合成的方法，随机合成特定长度肽的寡核苷酸片段，然后通过基因工程重组技术插入至噬菌体载体的外壳蛋白编码基因中并转化大肠杆菌，增殖和产生的噬菌体其表面携带有外源多肽，每个噬菌体表面表达一种外源肽，所有这些噬菌体构成随机肽库。利用目标分子从整个噬菌体随机肽库中经筛选一扩增一筛选等步骤，最后获得能与靶分子高亲和力结合的噬菌体克隆。通过测定该噬菌体的DNA序列后，就可知道噬菌体所携带的多肽氨基酸序列。 噬菌体肽库技术由两大核心内容组成：①利用丝状噬菌体或噬菌粒作为表达载体，通过基因工程重组技术将外源随机合成的DNA片段插入噬菌体外壳蛋白编码基因中，并在噬菌体表面展示该外源DNA所编码的多肽；②利用目标靶分子如抗体、受体蛋白等，在噬菌体随机肽库中与展示在噬菌体表面的多肽发生特异性结合，再通过有效的亲和淘选方法，筛选出高亲和力结合多肽的表达噬菌体。 噬菌体肽库的构建方法很多，要考虑的因素也很多，除了上面已经讨论的噬菌体衣壳蛋白的选择、随机多肽的展示方式以及展示系统的选择外，还要考虑构建肽库时选择所用的密码子和随机肽序列旁侧残基，以

构建噬菌体肽库的密码子选择 要建立一定长度的肽库 ，首先就是要人工合成相应长度的核苷酸随机序列，理论上核苷酸序列随机性越大，则肽库的多样性就越丰富。如密码子采用NNN合成方式，理论上可以得到所有可能且完全随机的氨基酸序列。但实际上其中有很多序列因存在着终止子而得不到表达，因此要尽量减少终止子在核苷酸序列中出现的频率。终止子有3个：TAA、TGA和TAG，因此密码子的合成方式一般选择(NNK)n、(NNS)”或(VNN)n(N＝A、G、C或T 4种核苷酸，K＝G或T，S＝G、C或T，V＝A、G或C)，这样可以在获得最大多样性的同时降低终止子出现的频率。如密码子采用NNK合成方式，则能够编码20种氨基酸和一个TAG终止子，这样就去除TAA、TGA终止子在随机核苷酸序列中出现的频率，其密码子的数目为4X4X2＝32个，其中有12种氨基酸的密码子各有1个，5种氨基酸的密码子各有2个，3种氨基酸各有3个密码子。如果采用含有琥珀抑制基因的菌株时，琥珀终止密码子TAG则不被识别，TAG翻译为谷氨酸。由于各种氨基酸的密码子个数不同，因而在肽库中出现各种氨基酸的比例是不相同的

随机肽的长度以及肽库的多样性 随机肽库的多样性标准和质量是以库容量来评价的。理论上，噬菌体展示的肽段越长，其肽库多样性即库容量就越高，筛选的成功率就越大。但实际上肽库的多样性或库容量是受到多种因素限制的，除了上面所讨论的受到合成时密码子的限制外，还受到DNA转化效率和宿主大肠杆菌体内生物性“选择”等因素的限制，如有些对宿主细胞不利的多肽一般是很难存在的。目前库容量一般只能达到109-1010。例如一个随机6肽库，如果是由20种氨基酸随机组成的话，可以产生206(即6．4X107)不同组合的肽序列。当用4种核苷酸合成编码6肽(即18个核苷酸)的随机DNA片段时，可以有(4X4X4)6即为6．9X1010不同组合的核苷酸序列。 如上所述，采用NNK合成方式，则编码随机6肽库的DNA基因片段为(4X4X2)6即1．07X109。由此可见，随机6肽库的库容量能够达到109以上，就认为是完全库。在这个随机肽库中，可能包含自然界中曾经出现过但已经被淘汰的肽，也可能包含正在存在的肽，甚至可能出现自然界中尚未存在或即将产生或很久以后才会出现的肽，因此可以认为肽库包含了这个长度所有可能的多肽。当然展示肽

编码 15 肽随机 DNA 片段的克隆 (1)M13KE载体的大量酶切 双酶切反应 体系： M13KE载体(1ug) 2 ul H2 O 32 ul 10XNE Buffer 3 4 ul EagI(10 U／ul) 1 ul Acc65 1(10 U／ul) 1 ul (共40 ul) 37℃孵育3h后，电泳纯化回收后，通过p―Agarase降解所含琼脂糖。 (2)酶切载体与合成片段的连接：为确保连接效率的最大化，同时采用不同的反应体系进行预连接，在每20ul的反应体系中，按照表进行反应，然后在16C连接过夜。 反应体系 ┌─────┬─────────────────┐ │ │ 3： l 5 ： l 10： l │ ├─────┼─────────────────┤ │