DNA 甲基化在肿瘤诊断中应用 表观遗传 学吸引入的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，使用表观遗传学方法可以有助于肿瘤的早期发现。现在肿瘤表观遗传治疗的主要研究方向包括DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的研制及靶向诱导DNA甲基化等。 癌症的早期发现对癌症患者的有效治疗是非常重要的。目前对癌症的诊断主要依据临床症状、图像信号检测和组织病理学检查等，但有许多癌症临床症状出现较晚，并且活体取样检测也困难，严重影响了癌症的早期诊断和病人的预后。研究发现甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，且此现象在确诊前就能被检测出来，提示某些基因的DNA甲基化水平有望成为肿瘤早期诊断的潜在指标，甚至可以作为患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的指标。 如前所述，监测DNA甲基化有多种方法，但由于MSP操作简单、灵敏、特异，而被认为在人类肿瘤甲基化分析中是一种快速、高效临床研究手段。通过检测血浆、血清、尿液和唾液等体液中肿瘤分子标记物的甲基化水平，解决了获取肿瘤组织困难所引起的问题，有利于肿瘤的早期诊断、预后

ERK信号转导通路 在MAPK家族中，ERK是最先被发现并被了解最多的成员。ERK包括了两种异构体ERKl和ERK2(分别为P44和P42)。两个磷酸化受体位点即酪氨酸和苏氨酸被谷氨酸残基分隔开来，故其磷酸化位点基序是TEY。目前认为，P38和JNK属于“应激诱导”的MAPK，而ERK被认为是与细胞增殖、转化和分化相关的MAPK。 ERK级联反应包括典型的3个层次MAPKs的序贯激活过程。Raf蛋白(MAPKKK)的激活能磷酸化MEKl／2(MAPKK)，并使后者激活，从而使随后的ERKl／2(MAPK)发生双重磷酸化而被缉获。ERK的激活对于Ras诱导的细胞反应、转录因子(如Elkl、cEtsl和c―Ets2)的激活以及激酶(如P90rskl、MNKl和MNK2)的激活是至关重要的。 ERK通路的激活包括了以下3种方式：酪氨酸激酶受体对Ras的激活、Ca2+对Ras的激活以及PKC对ERK通路的激活。生长因子与细胞表面的受体酪氨酸激酶(RTK)结合，诱发生长因子受体胞质中的酪氨酸残基自身磷酸化，导致受体二聚体化与活化。细胞表面的生长因子受体具有募集Grb2和SOS复合物的能力。SOS

细胞凋亡信号途径 细胞 凋亡本质上是一种程序性细胞死亡，是机体在生理或病理条件下，启动自身内部机制，经过多途径的信号传递，结束其自身生命的过程。细胞凋亡具有特征性的形态学及生物化学改变。凋亡早期主要表现为胞质空泡，染色质浓缩并沿核膜排列；凋亡细胞与细胞外基质或周围细胞分离。随着凋亡过程的进展，胞质空泡与胞膜融合，导致膜发泡，随后空泡与细胞分离，引起水分丢失，细胞皱缩，同时染色质进行性固缩，并碎裂成块状结构，最后细胞也碎裂成凋亡小体。凋亡小体是由细胞膜包裹的小泡，大小及内容物不一，可能含有胞内物质的任何部分。凋亡小体很快被周围细胞识别、吞噬并降解。凋亡过程中细胞膜和核膜保持完整，细胞内容物不会渗透至细胞外，因此不会引起组织炎症及瘢痕组织形成，凋亡发生后组织仍保持原有的结构及功能。 1．死亡受体介导的凋亡通路 “死亡受体通路”是由胞外肿瘤坏死因子(TNF)超家族的死亡配体如TNFa、FasL／CD95L、TWEAK和TRAIL引发的。这些配体和相关的细胞表面死亡受体(分别是TNFR、Fas／CD95、DR3、DR4／DRS)结合，

激光扫描共焦显微镜的应用 激光 扫描共焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)在传统荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合计算机对荧光图像进行加工处理，观察细胞和组织内部各个层面或不同侧面的形态变化。激光扫描共焦显微镜集激光技术、电子技术、光学设计及计算机于一体，它的优势为具有更高的分辨率，更大的反差，更大的视野厚度，它可实现无损伤连续的光学切片和真实三维结构的再现，除可以对细胞内被标记物定位之外，还可以进行定量，并能够实时跟踪记录细胞生理信号的变化。 激光扫描共焦显微镜的功能决定了其在生物医学中应用及独特的地位，它能对完整的活细胞和组织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量、定时和定位的测量。我们用不同颜色的荧光二抗标记两种不同的蛋白质，就能对这两种蛋白质的细胞定位以及蛋白质间是否相互作用进行观察。如果我们研究的对象是受体，借助标记荧光素的配基与受体的结合，可以用共焦显微镜研究受体在细胞内的三维分布，也可以用不同颜色荧光素标记的

免疫组织化学 - 体内原位检测信号分子表达变化 免疫组织 化学染色是引入附有标记物的外源性抗体(或抗原)，使之锚定于组织或细胞标本中相应的抗原(或抗体)部位，标记物经呈色反应而显示代检抗原(或抗体)，因此，免疫组织化学可按标记物的种类以及定位方法分类。按标记物分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫金银法、放射免疫自显影法等；按定位方法则分为一步法(又称直接法)、二步法(包括间接法、夹心法、补体法)和多步法(包括桥连法)等。一般说来，一步法染色步骤简捷，特异性强，但敏感性较差，且标记抗体适用范围窄。二步法及多步法经抗体放大，敏感性明显提高，标记抗体可一标多用，但染色步骤多、耗时，特异性不如直接法。 在组织学研究中，利用两种物质之间的高度亲和能力及其可标记性，以显示其中一种物质的方式称亲和组织(细胞)化学。这些亲和物质如葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A，SPA)与免疫球蛋白(IgG)、生物素(biotin)与抗生物素(avidin)、植物凝集素(1ectin)与糖分子、受体与配体，荧光素、酶、同位素等都可作为标记物而与之结合。

激光共聚焦法检测外源性 TFPI-1 与大鼠 MsC 膜上 TF 的结合情况 外源性加入组织 因子途径抑制物-1(tissue factor pathway inhibitor-1，TFPI-1)能够诱导大鼠肾小球系膜细胞发生凋亡。TFPI-1是组织因子(tissue factor，TF)的天然抑制物，TFPI-1的Kunitzl结构域能与TF-Ⅶa复合物结合。通过免疫荧光检测发现大鼠肾小球系膜细胞膜上有TF的表达。TF作为一种跨膜蛋白介导多条信号转导通路，从而引起细胞增殖。因此推测TFPI-1可能与肾小球系膜细胞膜上TF相结合，抑制TF介导的细胞增殖信号通路，引起大鼠’肾小球系膜细胞凋亡。这种推测用激光共聚焦的方法来加以证实。 1．材料 (1)培养在盖玻片上融合程度达到60％一70％的细胞。 (2)兔抗TFPI-1多克隆抗体、小鼠抗TF单克隆抗体，FITC马抗鼠IgG，TRITC羊抗兔IgG。 (3)冷丙酮固定液(一20~C预冷20min)。 (4)0．01mol／LPBS缓冲液。 2

亲和免疫组织化学 ABC 法检测 Thy-1 肾炎过程中肾小球内 TFPI-1 的表达 TFPI-1是体内主要的生理性抗凝物质，除具有抗凝作用外，还有抗炎、抗血管生成、 抗增殖及诱导细胞 凋亡等多种功能。研究证明，系膜细胞能分泌TFPI-1。为研究TFPI- 1是否对肾小球肾炎具有一定的疗效，首先应用亲和免疫组织化学ABC法观察了在大鼠Thy-1肾炎过程中TFPI-1的表达情况。 1．方法 (1)石蜡切片常规脱蜡至水：二甲苯1 3～5min(冬天可延长至5-10min)一二甲苯Ⅱ 3～5min---100％乙醇l一2min---~95％乙醇11～2min一95％乙醇Ⅱ1-2rain一80％乙醇 1min一70％乙醇1min---自来水洗片刻一蒸馏水洗片刻。 (2)去除组织内源性过氧化物酶活性：切片浸人1．5％H2 O2 -甲醇溶液，37C，301Tlln。 (3)切片水洗：蒸馏水洗7～8次。 (4)抗原修复(胰蛋白酶修复)：0．1％胰酶消化液(100 mg胰酶+100 mgCaCl2 溶于100m

细胞凋亡与肿瘤发生 肿瘤 的发生是多种因素相互作用导致正常细胞恶变的结果。导致肿瘤发生的外源性因素包括化学、物理、致瘤性病毒和真菌素等，内源性因素则包括肌体的免疫状态、遗传因素、激素水平、DNA损伤、原癌基因的激活和抑癌基因的失活等。归根到底，导致肿瘤发生的核心因素是基因调控的失常，典型表现是肿瘤细胞增殖和死亡速度之比的失衡，其中非常重要的一点便是细胞凋亡的抑制。 从细胞生物学的角度来看，细胞的主要生物学活动包括细胞增殖、细胞分化和细胞死亡。细胞凋亡是细胞在一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程。细胞凋亡是受细胞自身调控的主动过程，该过程具有一定的形态学特征和生物化学的改变，是一系列基因活动引起的级联反应的结果。凋亡调控的紊乱会造成一系列的疾病，如感染、神经退行性疾病、血液系统疾病、自身免疫病和肿瘤等。 肿瘤的研究经历了漫长而曲折的过程，但对其分子机制研究的突破是在癌基因和抑癌基因发现后才真正开始的。癌基因(oncogene)和抑癌基因(tumorsuppressorgene)是调控细胞生长、分

细胞凋亡的形态学研究 细胞凋亡概念形成于20世纪60年代，代表性论文发表于1972年，3位科学家(JohnKerr，AndrewWyllie，A1astairCurrie)对此功不可没。Kerr在研究肝供血和肝组织结构时首先提出“凝固性坏死”(shrinkagenecrosis)的概念。他发现结扎大鼠肝左叶与中叶的门静脉后所形成的肝叶萎缩与一般情况下的“坏死”不同。肝叶萎缩过程中肝细胞逐渐变圆，与周围脱离，细胞中出现染色质浓缩。组织化学显示这些细胞的溶酶体依然完好，同时发现该种“凝固性坏死”不引起炎症反应。Currie则建立了以多环羟碳氢化物――二甲苯甲蒽(9，10―山methy―1，2―benzanthracene，DMBA)诱导的Huggins鼠乳腺癌模型。他发现DMBA会诱导鼠肾上腺皮质细胞发生类似的“凝固性坏死”，并呈剂量依赖性。此后，Kerr、Currie与Wyllk一起对促肾上腺素(ACTH)对肾上腺皮质的作用作了大量的研究。1972年，3位科学家共同发表了具有里程碑意义的论文，正式提出“凋亡”的概念。由于该阶段的研究主要依赖于光镜和电镜，因而对凋亡的认识主要体现在形态学上

细胞凋亡的生物化学研究 1980年，Wyllie率先报道了凋亡细胞DNA的有序降解。凋亡早期，内源性核酸内切酶(endonuclease)活化后剪切染色质DNA。DNA的有序降解表现为形成180―200bP整数倍的寡聚核甘酸片段，在琼脂糖电泳中产生经典的“梯形条带”。染色质DNA的断裂多为单链断裂，断裂的位置大部分位于核小体之间的连接部位，因此容易造成核小体之间散布一系列的单链切口，这也是后来被应用于原位末端标记技术进行凋亡检测的理论依据。而染色质DNA断片可以被胞膜所包裹而形成凋亡小体，用吖啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)双染色后，在荧光显微镜下清晰可辨。 细胞凋亡是基因主动调控的过程，涉及基因及其蛋白质产物的激活。除了核酸内切酶的活化，Ca2+浓度的升高也是凋亡的一大特征。细胞凋亡的早期化学变化之一便是细胞内快速、持续的Ca2+浓度增高。内质网是细胞内的Ca2+储存库，内质网和线粒体共同调控细胞内Ca2+循环。正常情况下，Ca2+从内质网释放，被线粒体摄取，从而维持胞内Ca2+浓度的稳定。凋亡发生时线粒体膜电势降低，Ca2+摄人减少而内质网中的Ca2+仍然释放到胞质中，从而引起细胞

细胞凋亡的分子生物学研究 20世纪90年代以来，随着分子生物学技术手段的日新月异，精密仪器设备层出不穷，推动生命科学领域的研究迅速进入到基因调控和蛋白激活及其引起的信号转导途径等微观变化，对凋亡的研究也更趋向于凋亡的分子 机制和动态的过程变化。与此同时，20世纪肿瘤的研究在经历了70年代的癌基因时代、80年代的抑癌基因时代，到了90年代则进入了多基因，或者信号转导网络时代。正是在这一时期，大量的事实证明凋亡的基因调控与肿瘤的基因调控密切相关，而凋亡过程的抑制则是肿瘤发生的重要因素之一。 最早与凋亡相关的基因是在线虫中发现，主要是ced系列(ced―1～ced―14)，其中ced―3和ced―4为凋亡启动基因，ced―9是抑制凋亡的主要基因。之后的研究则发现在人类也存在类似的凋亡启动基因和凋亡抑制基因，其中白细胞介素―1p转化酶(interleukin―lpconvertingenzyme，ICE)基因与ced―3、ced―4同源，为凋亡启动基因，而Bcl―2家族则与ced―9同源，主要与凋亡抑制有关。p53、PTEN作为抑癌基因也被发现与

细胞凋亡的原理和概念 细胞凋亡的过程可以划分为诱导期、效应期和执行期。诱导期是指细胞接受各种凋亡信号的过程；效应期是指凋亡信号引起细胞内信号转导通路改变并激活关键性信号分子的过程；执行期则是被激活的水解酶切割细胞内底物并引起细胞形态学改变，细胞最后裂解的过程。细胞凋亡是极其复杂的生物学过程，特别是哺乳动物细胞的凋亡是由特定信号引起的，其过程涉及上百种基因的协作。参与细胞凋亡的基因往往具有多种生物学功能，比如p53基因不仅引起细胞凋亡，而且参与细胞的周期调控、分化和DNA损伤修复等多种过程。因此，对凋亡基因的分离鉴定造成了很大的困难。 事实上，凋亡研究上的突破是从一种最简单的无脊椎动物--线虫(caenorhabditis elegans)开始的。线虫在成长过程中共产生1 090个细胞，其中131个细胞发生凋亡。因此，线虫的成体由959个细胞构成(人体成体有1014个细胞)。由于线虫结构简单、生命周期短促、易于培养等特点，使其成为研究凋亡的理想模型。对线虫发育过程中凋亡的研究发现有14个基因参与凋亡，其中最重要的是促凋亡基因ced-4、抑凋亡基因ced-9和凋亡执行基因ced-3。ced

线粒体和凋亡 Mitchell于1967年提出了线粒体在氧化磷酸化过程中的作用，据此在1978年获得诺贝尔化学奖。此后线粒体的功能被定性为细胞的“动力工厂”，通过氧化磷酸化为细胞提供能量，因此不再受到重视。直到后来发现凋亡相关基因Bcl-2家族位于线粒体表面后，线粒体在凋亡中的作用又引起了广泛的关注，并且很快发现线粒体与凋亡的关系极其密切。凋亡诱导基因Bcl―2家族的不同家族成员与线粒体表面膜通道蛋白VDAC相结合而调控通道的开放和关闭，对线粒体通透性起调节作用。很多凋亡的关键步骤包括caspase激活物的释放和电离子通道的改变，以及线粒体膜电位差的丢失等都发生于线粒体，因此线粒体 对凋亡的发生或抑制起重要作用。 (一)细胞色素C释放与凋亡复合体的形成 在研究哺乳细胞凋亡的生物化学反应时，发现某些位于线粒体内膜的蛋白可以直接启动细胞凋亡，并导致细胞色素C释放到细胞质或细胞核。被释放的细胞色素C可以和Apaf―1结合，改变其构象，大大增加后者与dATP／ATP的亲和性，并且使细胞色素C―Apaf―1形成多聚体。与此同时，Apaf―1可以激活原形

生长因子与抗凋亡信号通路 生长因子(growth factor)是具有刺激细胞生长活性的细胞分泌蛋白。生长因子与细胞表面的生长因子受体结合引起多种细胞内信号通路的激活，最终导致细胞生长、分化、运动和抗凋亡等生物化学反应的发生。大量研究表明，生长因子及其受体的功能异常是肿瘤发生和发展的重要原因。最常见的生长因子配体和受体包括：表皮生长因子及其受体(EGF／EGFR)、肝细胞生长因子／离散因子(HGF／SF)及其受体(Met)、胰岛素生长因子(IGF)及其受体(1GFR)。此类生长因子受体具有酪氨酸激酶活性，可通过磷酸化调控下游信号通路的活性，其中PI3K／Akt信号通路对抗凋亡有重要作用，Akt相关信号通路的异常与多种肿瘤的发生相关。 PI3K是由相对分子质量为110 000催化亚基和相对分子质量的85 000调节亚基组成的异二聚体，具有脂激酶活性。正常状态下，P13K异二聚体存在于细胞质中。被生长因子激活的生长因子受体通过与P13K的调节亚基结合，将PI3K募集到细胞膜下脂质底物处。此外，生长因子与P13K结合引起的构象改变也会促进催化亚基的酶活性。生长因子受体可以通过Ras激活催化亚

p53基因的激活 p53是非常重要的抑癌基因。半数以上的人类肿瘤有高频率的p53基因突变或其他形式的功能失常。p53基因敲除的小鼠可发生多种肿瘤，进一步证实了p53基因异常与肿瘤发生和发展有密切关系。那么p53是如何抑制肿瘤发生的呢?p53被誉为基因组的卫士(guard“genome)。当DNA受到损伤时，p53基因被激活，导致细胞周期阻滞(cell cyclearrest)，并启动DNA修复机制，使损伤的DNA得以修复。然而，当DNA损伤过度而不能被修复时，p53会诱导细胞凋亡，杀死有DNA损伤的细胞。p53功能异常时，有DNA损伤的细胞不能及时被去除，这些细胞逐渐脱离正常的调控，最终可能形成肿瘤，因而p53诱导的细胞凋亡是抑制肿瘤发生的关键。 正常细胞内P53蛋白水平很低。当细胞中的DNA损伤或有其他功能异常时，P53水平升高，执行诱导凋亡的功能。p53基因表达的调控主要发生在蛋白质水平。虽然正常状态下p53的mRNA水平很高，而且有大量蛋白质合成，但P53蛋白极易降解。P53蛋白的降解主要通过泛素化(ubiquitin)实现。泛素化是细胞内蛋白降解的最普通机制，泛素化的蛋白质被蛋

凋亡与抗肿瘤治疗的策略 肿瘤的发生和发展是极其复杂的过程。个体差异、器官差异和致癌因素的差异都会对肿瘤的发生、发展和预后产生重要的影响。正是这一复杂性给肿瘤的治疗带来了很多困难。尽管对肿瘤发生和发展的机制尚未完全明了，甚至有争议，但是有一点共识便是肿瘤是恶性细胞“增生过度，凋亡抑制”的结果。肿瘤增生所产生的恶果显而易见：增殖过度的肿瘤压迫邻近器官，并造成侵袭和转移。凋亡是消除突变和损伤细胞的主要途径，凋亡抑制使本该消除的细胞存活，基因突变发生积累，基因的不稳定性增加。 传统的肿瘤治疗策略通常是以快速分裂的肿瘤细胞为靶细胞。使用细胞周期抑制剂治疗肿瘤，原因是它们能诱导肿瘤细胞发生凋亡。然而，此类手段的效果并不尽如人意。有证据显示，某些癌基因本身也是启动凋亡的因素。凋亡的过程是促凋亡因子和抗凋亡因子动态平衡的结果。简单地使用DNA损伤制剂在促凋亡的同时还会诱导抗凋亡因子表达，使肿瘤细胞发生凋亡的域值提高，最终产生耐药。 在一项对60种肿瘤细胞系的化疗敏感性的研究中，检测了使用不同化疗药物与促凋亡和抗凋亡基因表达的相关性，发现很多化疗制剂所诱导的耐药与Bcl-X、表达有关，提示该基因是发生耐

p53 诱导的细胞凋亡在肿瘤治疗中的应用 肿瘤 的化疗、放疗及生物学疗法是治疗肿瘤的重要手段。这些手段的主要机制在于利用化学药物、放射线或免疫制剂诱导肿瘤细胞发生凋亡，因而研究细胞凋亡在肿瘤治疗中极为重要。许多抗肿瘤药物或制剂如DNA交联剂、抗代谢药物和I／Ⅱ型拓扑异构酶抑制剂等都是通过激活p53来诱导细胞凋亡，但对p53突变的肿瘤则效果不甚理想。而紫杉醇主要针对突变的p53发挥作用。因此，针对肿瘤中p53的状态选择化疗药物非常重要。放疗的重要机制之一是放射线中的高能粒子(丁射线或X射线)能造成DNA损伤。p53的激活使细胞产生一系列的应激反应，如细胞周期停止、DNA修复和细胞凋亡，其中细胞周期停止和细胞凋亡是引起肿瘤消退的重要原因。p53在DNA损伤而诱导的细胞凋亡中起重要作用，p53基因突变会造成肿瘤组织对放疗不敏感。睾丸和骨髓组织对放射线的高度敏感，可能因为这些组织中P53蛋白水平较高，因此高水平的P53也是引起放疗副作用的重要原因之一。 肿瘤的生物学治疗主要包括免疫治疗，如利用各种细胞因子(IL-2，IL-6和IFN-γ)、抗体导

使用显微镜通过形态学检测细胞凋亡 细胞凋亡的检测有定性或定量两类方法。定性可以通过形态学观察，包括光镜、电镜和荧光显微镜等，也可以通过琼脂糖电泳来检测特征性DNA梯形条带。定量研究的首选方法为流式细胞仪。原位末端标记法则既可用于定性，又可用于半定量。此外，相比荧光显微镜，激光共聚焦技术提供了更高的分辨率，并可以作一定程度的断层扫描，利用相应的软件可以把图像压缩成三维立体图形。荧光显微镜和(或)激光共聚焦与定时摄影技术相配合，可以记录凋亡过程的动态变化。 如前所述，早期的凋亡主要依赖光镜和电镜进行形态学研究。光镜主要是对HE染色的切片进行观察，在镜下可见染色体核浓缩等。但因其提供的信息有限，现已不常用。利用相差显微镜，在高倍下观察可见凋亡细胞 膜的泡化(bledding)及细胞膜和核膜的折光性改变，但这些改变不是普遍现象。相对而言，电镜的分辨率高，可以显示细胞各个亚器官的变化。荧光显微镜既可定位，又可做定量分析，因而更常用。 (一)透射电子显微镜 电镜分为透射电镜和扫描电镜，观察细胞一般使用透射电镜。透射电镜的优势是

双苯咪唑类的Hochest-33342和33258及 JC-1染色 双苯咪唑类的Hochest-33342和33258 该染料可渗透细胞 膜进入细胞内，与DNA结合，使之染色。凋亡细胞对该染料的摄取增高，染色后呈强蓝色荧光。其实验方法如下。 (1)细胞培养及凋亡的诱导：将细胞接种在10cm的培养皿中(106 细胞)，在适当的时机诱导细胞凋亡。 (2)收集细胞：悬浮生长的细胞可直接离心收集(1 000r/min，5min)。对于贴壁生长的细胞可以先收集细胞培养液(可能含有因凋亡而悬浮的细胞)，再用胰酶消化贴壁细胞，然后将两者合并，离心收集细胞并用1×PBS洗细胞沉淀物。 (3)固定：细胞沉淀物悬浮在300ul甲醛(4％)中固定30min，然后经PBS洗涤后离心收获细胞。 (4)染色：细胞在100ul Hoechst-33342(sigma)中染色10min，然后将细胞悬液滴在载片上，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察并拍照片。 JC-1染色

细胞凋亡研究方法的应用 以下将说明如何运用上述研究方法探索p53诱导细胞凋亡的机制。大多数肿瘤细胞都有p53基因的突变或功能丧失。携带野生型p53的细胞 中P53蛋白的水平很低，不足以引起细胞凋亡。因而，建立外源P53高水平表达的细胞系统对研究p53诱导凋亡具有重要意义。观察p53表达和激活引起的细胞生长停止或细胞凋亡，只能在p53基因可控表达细胞系中进行，如用四环素药物控制的p53表达系统。1990年，Michalovitz等报道了温度敏感型p53突变体p53-vall35。这种小鼠p53基因突变体的第135位密码子被突变为缬氨酸。在38~C，P53蛋白没有活性；在32~C，P53蛋白恢复野生型构象和功能。表达p53-vail35的细胞在非激活温度(37℃)时正常生长，而转移到激活温度(32C)后，细胞则停止生长或凋亡。1995年，Tsuchida等建立了人p53基因温度敏感突变体p53-vall38，并使p53-vall38在Jurkat细胞中和骨肉瘤细胞Saos-2中表达。当培养在激活温度时，Jurkat／p53-vall38(J138V)出现细胞凋亡