双抗体夹心ELISA法检测待测样品sIL-2R含量 【基本原理】 选用两株针对sIL-2R分子不同位点的单克隆抗体，即McAb1 （包被抗体）与McAb2 （酶标抗体）。先用McAb1 包被固相载体，使待测sIL-2R与之特异性结合，然后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的McAb2 ，则形成McAb1 -sIL-2R-HRP标记McAb2 复合物，再加入HRP底物（邻苯二胺），则酶催化底物而显色，测定样品与标准品OD值，绘制标准曲线，即可从标准曲线中查得待测样品中sIL-2R含量。该法敏感性高，且特异、简便、快速、取材容易，故较为常用。 【材料和试剂】 （1） 包被抗体（McAb1 ）：使用时用包被液作适当稀释（如1：100）。 （2） 酶标抗体（McAb2 ）：以辣根过氧化物酶（HRP）标记。使用时用稀释液做 适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定。 （3） sIL-2R标准品：已知含量的sIL-2R，使用时用稀释液作倍比稀释成7个浓度：1600u/ml， 800u/ml， 400u/ml， 2

ELISA 抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量 【基本原理】 本法是用纯化或重组的IL-2R(α链，P55，CD25，Tac抗原)蛋白包被96孔酶标反应板，同时加入已知量的抗IL-2RMcAb，再分别加入sIL-2R标准品与待测样品。则待测sIL-2R或者sIL-2R标准品与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白竞争与抗IL-2R McAb结合。通过与标准品对照，从抗IL-2R McAb与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白结合受抑制程度来求得待测样品中sIL-2R含量。 【材料和试剂】 （1） 纯化或重组的IL-2R蛋白（α链，P55，CD25，Tac抗原）（40.000u/ml） （2） FITC标记的抗IL-2R McAb（0.2μg/ml）：FITC为异硫氰酸荧光素，这里仅作为半抗原使用，而不作为荧光素标记。 （3） 碱性磷酸酶标记的兔抗FITC抗体（酶标抗体） （4） 对硝基苯磷酶盐底物液；用pH9.8的二乙醇胺缓冲液溶解，配成浓度为1mg/ml。 （5） 1

间接免疫荧光法检测样品中mIL-2R α + 阳性细胞 白介素2受体（interleukin 2 receptor， IL-2R）是能与白介素2（IL-2）特异性结合的细胞受体。IL-2R由α、β、γ链组成。IL-2R存在形成包括膜结合型IL-2R（membrane-bound IL-2R，mIL-2R）与可溶性IL-2R（solubble IL-2R，sIL-2R）。sIL-2R是由于某种因素（如位点特异性蛋白酶裂解作用）使mIL-2R α链（P55，CD25，Tac抗原）脱落进入体液而形成，（是mIL-2R的清除形式之一）。体液中sIL-2Rα升高是抗原强烈刺激的标志以及T淋巴细胞活化的标志。sIL-2R由mIL-2R+ T细胞释放，可存在于血清、尿液及淋巴细胞培养上清液中。应用标记的抗IL-2R特异性抗体和抗原抗体反应可检测待测样品中sIL-2R含量，也可检测mIL-2R。目前多以双抗体夹心ELISA法或ELISA抗原竞争法检测sIL-2R含量，以间接免疫荧光法或放射免疫法检测mIL-2R。 【基本原理】 利用抗IL-2Rα McAb(

IL-2 质粒DNA探针制备的操作步骤 （1）含IL-2质粒DNA探针的提取 取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基（含100μg/ml Amp） ↓37℃ 220r/min 振摇过液(约16h ) 取10ml菌液加200ml LB培养液(含100μg/ml Amp) ↓37℃ 150r/min振摇 4h 加氯霉素(终浓度170μg/ml) ↓37℃ 220r/min振摇3h 菌液倒入300ml离心管中离心 ↓4℃ 5000r/min×10min离心弃上清除去残液(吸水纸无菌) 每管加40ml STE溶液(冰预冷)悬浮细菌后，用移液管转入到50ml离心管中 ↓4℃ 5000r×15min离心 弃上清，加5ml溶液1(冰预冷)悬浮细菌，加1 ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10g/ml) ↓轻摇，室温静置5min 加10ml溶液II，盖上盖子，将离心管小心颠倒数次混合液体，不要用旋涡振荡器 ↓冰浴10min，且勿摇动 加7.5ml溶液III(冰预冷)摇振荡离心管数次使之混合 ↓冰浴2

IL-2 DNA探针的标记 地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的类固醇半抗原，又称异羟基洋地黄毒甙配基，地高辛精可以通过一个11个碳原子的连接臂与尿嘧啶核甘酸嘧啶环上的第5组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶甘酸:Boehringer Mannheim公司出售的地高辛精标记核苷酸有dig-UTP，dig-dUTP和dig-dduTP，它们分别适用于RNA探针、DNA探针和寡核苷酸探针的标记。地高辛精标记核甘酸主要通过酶反应标记核酸探针，用标记探针做原位杂交，杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。在适宜的标记反应条件下，一般在20-25个核苷酸中带有一个标记的核苷酸。这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛精之间的反应。因为一个标记抗体大约覆盖20个核苷酸。Boehringer Mannheim公司生产的地高辛精DNA标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛。【试剂与仪器】（1） 地高辛标记和检测试剂盒（Boerhinger Mannheim，No1093657）：其中包括六聚核苷混合物，dNTP混合物，Klenow聚合酶等（2） 乙醇，LiC

原位杂交法测定TNF的mRNA 原位杂交 【试剂及配制】 （1） TNF-DNA探针 （2） 地高辛标记液试剂盒 （3） 杂交液：60%去离子甲酰胺，300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2 PO4 (pH7.4)，5%葡聚糖硫酸酯，250μg/μl变性鲑精DNA （4） 设备：温箱，水浴锅，加样器，吸头，染色缸等 【操作步骤】 （1） 用地高辛标记DNA探针，参见上面介绍的“斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量”； （2） 准备杂交液； （3） 临用前，将DIG标记的DNA探针在80℃加热10分钟，迅速置冰浴中变性后，将其加入杂交液中，至终浓度5μg/μl； （4） 将10-20μl杂交混合液（杂交液加变性探针）加入到固定并增加了通透性的细胞上，盖上专用原位杂交盖玻片，放入盛有约20ml 20%甘油湿盒内37℃使其杂交过液

瑞氏（wright）染色法检测细胞凋亡 【材料与试剂】 Wright染液：称取Wright粉剂0.1g在碾钵内，充分碾磨，量取甲醇60ml，逐步加入，边加边碾磨，直到染料全部溶解，置试剂瓶中密封，1周后可用。 Wright磷酸盐缓冲稀释液：Wright染液10 ml，磷酸盐缓冲液20ml。 磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾6.63g，磷酸氢二钠2.56g，蒸馏水1000ml。 染色缸，离心涂片机，离心机，显微镜。 其它：甲醇，0.08%醋酸，中性树胶。 【操作方法】 收集细胞（1×106 ），PBS洗1次； 将以上细胞涂片或用离心甩片机制成细胞甩片； 用甲醇固定3～5min； 将标本玻片插入 Wright染液缸中染色2 min； 再插入Wright磷酸缓冲稀释液染色4～10min，用蒸馏水冲洗。如果颜色太深，可用0.08%醋酸分化数秒钟； 晾干，用中性树胶封片； 【结果判断】 正常细胞核染成深蓝色或蓝紫色，色泽均一，凋亡细胞可见核固缩，破碎，染色变深，细胞膜皱缩，出泡，出现凋亡小体。 （三）Giemsa（姬姆

Hoechst/PI 双标记法检测细胞凋亡 凋亡细胞在等渗条件下进行活细胞染色，其吸收Hoechst的能力增强。因此，在活细胞中加入Hoechst染料，凋亡细胞很快产生较强的蓝色荧光，其强度要比坏死的和活的细胞大得多。Hoechst/PI双标记法是目前细胞凋亡最满意的形态学分析方法。先用Hoechst进行活细胞染色，再进行PI染色，并与细胞光散射性质测定结合起来。Hoechst/PI双标记法也适用于不发生DNA断裂的凋亡细胞的测定。 【材料与试剂】 Hoechst 33342储存液（0.1mg/ml）：配制方法同上述。 PI储存液（1mg/ml）：配制方法同上述。 PBS 培养细胞或离体细胞制成的单细胞悬液。 【操作方法】 将106 个细胞悬浮于1ml培养基（含10%小牛血清）中，加入10μl Hoechst33342储存液，混匀； 置于37℃温育5～15min； 将细胞置于冰上冷却后，于4℃离心，去除上清； 将细胞重新悬浮于1ml PBS中，加入5μl PI储存液，混匀，37℃复染10~15mi

凋亡早期，细胞表面可发生改变，细胞膜的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从胞膜内转移到胞膜外层，从而使 PS 暴露在细胞表面。在凋亡发生时，巨噬细胞能特异性识别暴露在细胞表面的PS，从而吞噬凋亡细胞和凋亡小体，使机体免于细胞内容物释出所引起的炎症反应和伴有的组织细胞坏死。Annexin-V 是一种 Ca2+ 依赖性的磷脂结合蛋白，与 PS 有高度亲和力。因此该蛋白可以作为一种敏感的探针，用以检测暴露在细胞膜外层的 PS，故适合凋亡细胞的检测。由于坏死细胞失去膜的完整性，PS 也会暴露，故必须区分凋亡细胞与坏死细胞。用一种 PI 染料做染色排斥实验，就可以从 Annexin-V 染色阳性细胞群中区分出坏死的细胞。在荧光显微镜下观察，正常细胞无任何荧光标记；凋亡细胞膜上染有黄绿色光环；坏死细胞膜上染有黄绿色光环，胞核被 PI 染成红色。 一、材料与试剂（1）Annexin-V-FLUOS Staining Kit：Annexin-V-Fluorescein （瓶 1）Propidium iodide （瓶 2）Binding Buffer （瓶 3）标记液的配制（用于 10 份试验）：将 20

基于凋亡诱导蛋白酶变化的细胞凋亡检测 半胱-天冬氨酸蛋白酶家族（cysteinyl aspartate specific protease，Caspase）是近几年人们发现的与ced-3同源的一类蛋白酶，具有10余种成员。“C”代表半胱氨酸在酶的活性中心，“aspase”代表其底物切割蛋白作用位点都在天冬氨酸羧基端，这是caspase家族最为独特的催化活性。Caspase一般以非活化的酶原形式广泛存在于大多数细胞中，研究认为，一些caspase家族成员可在凋亡中被活化，继而活化其他的caspase，产生放大级联反应并切割底物，从而介导凋亡的极早期发生过程。例如caspase家族成员之一caspase 3在某些特定效应分子（尤其是TNF和Fas）诱导的细胞凋亡中是必不可少的。 由于caspases家族可能是启动生化过程从而导致凋亡的最为重要的效应分子之一，因此对caspase活化的分析较其他常用的方法更能检测出凋亡的早期发生。Caspase可以切割多种重要底物， PARP是其中之一。PARP的裂解是细胞凋亡发生最有价值的标志，可以通过Wes

[材料与试剂] (1)平衡缓冲液； (2)反应缓冲液； (3)TdT酶； (4)反应终止/洗涤液； (5)过氧化物酶标记的抗地高辛抗体； (6)蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS； (7)30％H2 O2 ； (8)DAB显色液：0.05％的diaminobenzidine (DAB)溶于PBS，用前过滤并加入0.02％H2 O2 ； (9)甲基绿染液：0.5％甲基绿溶于0.1mol/L枸橼酸钠，pH调整到4.0； (10)塑料盖玻片及玻璃盖玻片。 [样品来源] 同荧光标记法。 [操作步骤] (1)固定：同荧光标记法； (2)内源性过氧化物酶封闭：玻片置于盛有0.5％H2 O2 缓冲液的染色缸内，室温下作用20min 后，同荧光标记法洗涤； (3)消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消

细胞凋亡的相关蛋白分析 已发现有许多基因参与调控细胞凋亡，这些基因编码的产物可参与促进或抑制细胞凋亡的发生、发展。在此主要讨论其中几种主要的细胞凋亡调节基因蛋白的特征及其检测。 起初对凋亡调节基因的研究均以一种秀丽隐杆线虫（C.elegans）为模型。大量研究表明线虫细胞死亡基因（caenorhabditis elegans cell death gene， ced gene）与此线虫体细胞凋亡有关。其中，ced-3和ced-4基因所编码的蛋白可激活细胞凋亡的启动。与此相反， ced-9基因产物可以保护细胞不至发生凋亡。换言之，当ced-3和ced-4蛋白水平较高， 而ced-9蛋白表达量较低时，细胞凋亡易于发生。在哺乳动物系统中，bcl-2原癌基因与ced-9具有类似的功能，可通过阻止凋亡的发生而延长细胞存活时间。另一种哺乳动物基因产物p53则被认为是一种肿瘤抑制基因， 因其可诱导肿瘤细胞凋亡的发生。p53缺失或突变均可导致细胞的恶性转化或永生化。Fas（CD95/Apo-1）为一种细胞表面受体基因，广泛表达于机体多种组织细胞（尤其是免疫细胞）表面。抗Fas抗体或Fas配体（FasL

HLA 等位基因序列特异性探针（SSO）及其标记 （一）DRB1分型SSO探针 根据分辨率的要求选择。 常用的DRB1分型的SSO探针见表 代号 SSO探针的DNA序列（5’-3’） DR特异性 L11 TTCAAACTTAAGCTGCCAC DR1 D11 CTCATACTTATCCTGCTGC DR2 N77 TCTGCAGTAGTTGTCCACC DR3 H33 CTCTTGGTGATAGAAGTATC

PCR-SSO 预杂交和杂交 【材料和试剂】 （1） 50 X Denhardt：2.5g聚蔗糖400，2.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），2.5g牛血清白蛋白（BSA），加蒸馏水250ml。 （2） 预杂交液：5XSSPE，5Xdenhardt液，0.5%SDS，100ug/ml变性并裂解的鲑精DNA。 （3） 50%甲酰胺 （4） 10 X SSPE（p H 7.4）：100mmol/L NaH2PO4，1.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA。 （5） 固定有样本DNA的尼龙膜 （6） 标记的SSO探针 （7） 杂交炉或杂交袋 （8） 恒温水浴摇床（80rpm，有盖，温度可调至65℃） （9） 精确温度计（精度为±0.1℃） （10） 可调加样器（1～20ul，20～200ul，200～1000ul） 【操作步骤】 预杂交和杂交可以在杂交炉或

PCR-SSO 结果显示与结果分析 【仪器和试剂 】 （1） 感光胶片 （2） 带有增感屏的暗合 （3） X光片冲洗试剂和设备 【操作步骤 】 （1） 洗膜完毕后，用塑料薄膜将其包好，与感光胶片一起装入带有增感屏的暗合中，在低温冰箱中进行放射自显影。曝光时间需要摸索，通常为数十分钟至数天，视探针的放射性比活和洗膜程度而定。 （2） 曝光完毕后，在暗室中将感光胶片取出，常规方法进行显影和定影，观察结果。 【注意事项】 放射自显影完毕后，尼龙膜上的探针可以用0.1N NaOH溶液洗脱，以便用其他探针杂交，但要求在杂交之后的整个实验过程中，尼龙膜要保持湿润，不能干燥。 结果分析 （1） 在每张尼龙膜上应有相应SSO探针的阳性和阴性DNA作为对照，其杂交信号应该具有明显的差异。 （2） 分析杂交结果时，通过杂交的信号强度（注意与对照DNA的信号比较），一般可以判断阳性杂交的样本。如果样本DNA能

PCR-RFLP HLA 分型技术 限制性核酸内切酶的识别位点具有严格的DNA序列特异性，不同型别HLA抗原的编码基因在DNA序列上存在差异，用一组限制性核酸内切酶对经PCR扩增后的HLA基因片段进行酶切，由于在不同HLA等位基因上限制性酶切位点的分布存在差异，酶切后的PCR产物经凝胶电泳后就会显示不同的电泳带型，借以鉴定HLA基因的型别。图10-2是采用PCR-RFLP技术进行HLA-DRB1等位基因型别鉴定的示意图。 PCR-RFLP原理示意图 PCR-RFLP方法有以下优点：（1）PCR-RFLP方法远较PCR-SSO方法（指一般的PCR-SSO方法，而不是PCR-反相SSO方法）简单和实用，因为PCR-RFLP不需要制备和标记众多的SSO探针；（2）在鉴定单个碱基差异方面，PCR-RFLP方法可能比PCR-SSO方法更为简便和准确，因为PCR-RFLP方法无须繁琐地调整杂交和洗膜的条件；（3）PCR-RFLP显示二个酶切位点之间的长度，这种信息有利于鉴定某些不能用PCR-SSO方法区分的杂合子，例如用PCR-SSO技术进

PCR-SSP HLA 分型技术 PCR-SSP（sequence specific primer）分型技术是根据编码各种HLA抗原的等位基因的碱基排列顺序，设计并合成与之互补的寡核苷酸作为PCR引物，样本中HLA等位基因能够用相应的引物（即SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，SSO仅扩增与其互补结合的HLA等位基因，而不扩增其他的等位基因，PCR扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。因此，采用SSP引物对样本DNA进行扩增之后，PCR扩增产物的有无是鉴定HLA等位基因的基础。 提取待测标本基因组DNA ↓ 采用SSP引物进行PCR扩增相应HLA基因 ↓ 扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物 ↓ 根据PCR产物的出现进行待测标本的HLA型别判断 PCR-SSP分型技术的优点为操作简单、快速，可借助自动化设备进行操作；结果直接在琼脂糖电泳凝胶上观察，判断容易，杂合子也容易检出；缺点是必须采用多对SSP引物进行扩增，而且对空气中DNA气溶胶污染比较敏感。 【试剂配制和仪器要求】 1 、主要试剂 （1） 等

PCR-SSP 扩增体系的组成和准备 （一）SSP引物混合液的准备 预先准备好所有引物的混合液，其中包括除Taq多聚酶和待测基因组DNA之外的所有PCR反应成分，即： （1） 2pmol 5’ 末端和3’末端的引物 （2） 2pmol 内参照引物（β-actin基因引物） （3） 200umol 各种d-NTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP） （4） 1 X PCR缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01%明胶。 （5） Ficoll 400 （终浓度为1%，V/V） （6） 加样缓冲液（甲酚红，终浓度为0.001%，W/V） 上述引物混合液准备好后，分装至作好标记的PCR扩增管中，每扩增管中上述引物混合液的体积为36ul，反应体积的调整使用双蒸水，不要使用TE，EDTA 可抑制Taq多聚酶的活性。置于-20C保存，临用时取出。 （二）DNA/Taq多聚酶混合液的准备 （1） 计算扩增所需管数，每对SSP引物须用一只扩增管单独扩增；

常用HLA DNA分型技术的特点 1 、PCR-SSO PCR扩增的序列是具有多态性的HLA等位基因外显子，HLA-I类基因主要是第2和第3外显子，HLA-II类基因主要是第2外显子，PCR扩增产物用一组探针进行杂交，每一探针与相应型别的HLA等位基因序列互补。HLA等位基因特异性的探针可以检测已知序列的HLA等位基因。因此PCR-SSO是一种常用而精确的HLA基因分型方法，通常是将多个待测样本的PCR扩增产物固定在同一杂交膜上，然后分别与不同的探针杂交，所以该方法特别适用于大批量样本的分型；缺点是设备要求高、操作过程复杂，难以在短时间内完成全部HLA等位基因的分型。 为了简化上述方法的操作步骤和缩短分型时间，根据SSO分型原理，建立了反向SSO分型方法。该方法是将一组HLA-I类或II类等位基因特异性探针固定在同一杂交膜上，PCR扩增产物经过生物素或其他标记物标记后，与固定在杂交膜上的探针杂交。洗涤后加入链亲和素-过氧化物酶偶联物和相应底物，显示与探针杂交的PCR扩增产物。反向SSO分型方法操作简单，耗时短（4～6小时），并且适合小量样本的分型。主要缺点是

常用HLA DNA分型技术的选用 HLA分型方法的选用首先取决于HLA分型的目的，组织配型中常用的是中等分辨率的分型技术，即分辨出与HLA抗原特异性相对应的HLA等位基因型别，而在某些研究中需要高分辨率的HLA分型，即需要分辨出HLA型别中的各种亚型。上述每一种DNA分型技术的分辨率都高、中、低的区别，在掌握各种分型方法的基本原理的前提下，通过改变SSO探针的组合，或限制性核酸内切酶的组合，或SSP引物的组合，可以改变分型方法的分辨率。 不同HLA分型方法所需的时间也不同，也是选用HLA分型方法时应该考虑的问题，例如作为组织配型就要求在较短时间内得到HLA分型结果，而作为研究对时间的要求就要求不严。 分型方法的选用还取决于各实验室的条件，如果实验室基础较好，选择的余地也宽；如果实验室没有HLA分型的基础，应该选择操作较为简便的方法。在上述HLA分型方法中，值得推荐的是PCR-SSP，这种方法的操作较为简单、结果直观、时间和费用消耗少，而且分辨率可以根据需要进行改变，不足之处是SSP引物混合液的配制和分装较为复杂。