细胞因子及其受体的检测 细胞因子（cytokine，CK）是指由免疫细胞（如T细胞、B细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞等）和某些非免疫细胞（如内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞、骨髓及胸腺基质细胞等）经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质，多属分子量为6～60KD的多肽或糖蛋白。 细胞因子通常包括白细胞介素（interleukin，IL）、干扰素（interferon，IFN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、造血因子、趋化因子、各种细胞生长因子等。 细胞因子在体内广泛参与免疫应答及调节、促进组织修复、刺激造血功能、刺激细胞的增殖与分化、参与细胞凋亡等重要生理活动；某些因素可导致一些细胞因子的异常表达或功能异常，从而参与炎症反应、免疫性疾病、肿瘤性疾病等病理过程的发生与发展。细胞因子必须通过与靶细胞膜表面特异性受体（即细胞因子受体，cytokine receptor，CKR）相结合才能发挥其广泛的生物学效应。因此，细胞因子及其受体的检测，无论是对基础免疫学研究，还是对阐明某些疾病的发病机制、疾

IL-1 的体外诱生 IL-1主要由活化的单核/巨噬细胞产生，具有广泛的生物学活性。IL-1包括IL-1α和IL-1β，两者分子量相近，且均能与IL-1R结合，故具有相似的生物学活性，常用的IL-1生物活性检测法对两者均适用。常用的IL-1生物活性检测法包括：小鼠胸腺细胞增殖法、L929细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法等。这些方法均不能区分IL-1α与IL-1β，只能用免疫学检测法才能加以区分。由于体液中IL-1含量极少，难以直接测定，故通常是通过检测体外诱生的IL-1来反映体内IL-1活性水平。 【基本原理】 LPS是IL-1α与IL-1β的诱生物，能在体外诱导单核/巨噬细胞产生IL-1α与IL-1β。下面重点介绍以小鼠腹腔巨噬细胞活性制备IL-1。 【材料和试剂】 （1） BALB/c或C57BL/6小鼠：6-10周龄，雌雄均可。 （2） 75%酒精 （3） LPS：10% FCS-RPMI-1640培养液配制成10μg/ml。 （4） 5% FCS-HBSS（Hanks液），10% FCS

L929 细胞增殖MTT比色法检测IL-1的生物活性 【基本原理】 IL-1具有刺激多种来源的成纤维细胞增殖的作用，可用于IL-1生物活性检测。目前国内外大多数实验室常用L929细胞株（小鼠成纤维细胞瘤细胞）作为检测IL-1生物活性的靶细胞或反应细胞。MTT比色法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT-甲肷，形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关。故通过反应细胞形成的MTT-甲肷量，即可测定IL-1对L929细胞促增殖作用程度，从而间接测定IL-1的生物活性。 【材料和试剂】 （1） 已诱生的IL-1待检样品：倍比稀释成不同浓度。 （2） IL-1标准品：倍比稀释成不同浓度。 （3） L929细胞：作为反应细胞或靶细胞，存活率应>95%。 （4） 0.25%胰蛋白酶 （5） 10%FCS-RPM

小鼠胸腺细胞增殖3 H-TdR掺入法检测IL-1的生物活性 【基本原理】 IL-1可协同有丝分裂原（如ConA或PHA）刺激的T细胞或胸腺细胞发生增殖反应，通过3 H-TdR DNA掺入法，即可测定IL-1生物活性。此法是目前测定IL-1活性常用而简便的方法，其敏感度达10-50pg/ml。但本法缺乏特异性，因为IL-1亦可刺激T细胞或胸腺细胞产生一些细胞因子（如IL-2等），同样可协同有丝分裂原刺激细胞增殖，且在细胞增殖过程中还可受到样品中T细胞增殖抑制因子的干扰。 【材料和试剂】 （1） 小鼠：BALB/C或C57BL/6小鼠，6-10周龄，雌雄均可。 （2） 75%酒精 （3） 5% FCS-RPMI-1640完全培养液与RPMI-1640完全培养液 （4） ConA或PHA （5） IL-1标准品：倍比稀释成至少6个不同浓度值。 （6） IL-1待测样品：倍比稀释成至少6个不同浓度值。 （7） 3 H-TdR、β-液闪汁数仪，微量细胞收集仪 （8） 解剖刀、

IL-2 的体外诱生 IL-2主要由活化的CD4+ T细胞产生，主要是促进T淋巴细胞的增殖与分化。IL-2是机体免疫网络中最重要的细胞因子，因此IL-2的检测已成为评价机体免疫功能状态的重要指标之一。但由于IL-2是通过自分泌或旁分泌方式发挥其生物学效应的，在生理性免疫应答过程中，IL-2不出现于血液等体液中，故体液中IL-2含量极少，难以直接测定，通常是通过检测体外诱生的IL-2来反映体内IL-1活性水平。IL-2可用免疫学方法来检测其含量，但更多是用生物活性检测法来检测其活性单位。 【基本原理】 PHA或ConA是IL-2的诱生物，能在体外诱导人外周血单个核细胞和组织细胞（如人脾脏、扁桃体、淋巴结）、小鼠和大鼠脾脏细胞等产生IL-2，由此可用于检测IL-2的生物活性。 1、人外周血单个核细胞诱生IL-2 【材料和试剂】 （1） 常规分离的外周血单个核细胞（PBMC） （2） RPMI-1640培养液，含10% FCS的RPMI-1640完全培养液 （3） PHA（初浓度为2mg/ml） （4）

MTT 比色法检测IL-2的生物活性 【基本原理】 IL-2的生物活性检测法是检测IL-2对靶细胞（或反应细胞）的促增殖作用的能力。IL-2反应细胞增殖程度可以增殖细胞中DNA合成或酶活性为指示系统，通过测定3 H-TdRDNA掺入量或MTT比色法OD值，并通过与标准品对照，间接测定IL-2的生物活性单位。以下三类细胞可作为IL-2的检测细胞：①IL-2依赖细胞株，如CTLL，CTLL-2，尤以后者最常用；②有丝分裂原活化的T淋巴母细胞；③小鼠胸腺细胞。下面主要介绍以CTLL-2细胞作为反应细胞检测IL-2的生物学活性，又包括MTT比色法与3 H-TdR掺入量两种基本方法，其原理参见IL-1的生物活性检测部分。 【材料和试剂】 （1） CTLL-2细胞：作为反应细胞或靶细胞。 （2） 待测样品：从1:2开始作倍比稀释，至少6个稀释度。 （3） IL-2标准品：同上作倍比稀释，至少6个不同稀释度 （4） 10% FCS-RPMI-1640完全培养液 （5） MTT：用PBS配成浓度为5mg/ml的MTT溶液，用0.22μm

3 H-TdR 掺入法检测IL-2的生物活性 【材料和试剂】 （1） 反应细胞：CTLL-2，存活率应＞95%。 （2） IL-2标准品：倍比稀释为不同浓度。 （3） 待测样品：倍比稀释为不同浓度。 （4） 10% Fcs-RPMI-1640完全培养液 （5） 3 H-TdR （6） 96孔培养板，刻度吸管，毛细吸管，刻度离心管，离心机，加样器（头），细胞计数板，倒置显微镜，超净工作台，CO2 培养箱，微量细胞收集仪，玻璃纤维滤纸，ß液闪计数仪。 【操作步骤】 （1） 用10 %FCS-RPMI-1640培养液洗涤CTLL-2细胞2次，1000r/min离心5min，以去除原生长培养液（含IL-2）； （2） 用10% Fcs-RPMI-1640培养液调细胞浓度为1×105 /ml； （3） 将不同倍比稀释度的IL-2的标准品和待测样品分别加入96孔细胞培养板，100μL/孔，各设3复孔，同时设培养液对照； （4）

MTT 比色法检测TNF的生物活性 【操作步骤】 （1）取对数生长期的L929细胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗涤细胞2次，以去除消化液及原生长培养液； （2）用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml； （3）将上述细胞悬液加至96孔培养板，100 ul/孔； （4）置37℃，5% CO2培养箱中培养24h； （5）吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品，100ul/孔，各设双复孔，并设培养液阴性对照及空白对照（即L929细胞、标准品及待测样品均不加入，仅加培养液）； （6）同时向各孔均加入10ul放线菌素D（0.5～1μg/孔）； （7）置37℃，5% CO2培养箱中培养12-14h； （1） 直接于每孔中加入MTT溶液，10μl/孔 ，37℃孵育4h； （2） 从每孔中轻轻吸出培养上清液100μl/孔 ，弃去 ，再于每孔中加入酸化异丙醇或DMSO，100μl/孔，混匀，置室温10min； （3） 用酶标仪以检测波长5

双抗体夹心ELISA法检测待测样品sTNF- α 含量 【基本原理】 选用两株针对TNF-α分子不同位点的单克隆抗体，即McAb1 （包被抗体）与McAb2 （酶标抗体）。先用McAb1 包被固相载体，使待测sTNF-α与之特异性结合，然后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的McAb2 ，则形成McAb1 -sTNF-α -HRP标记McAb2 复合物，再加入HRP底物，则酶催化底物显色，测定样品与标准品光密度值（即OD值），绘制标准曲线，即可从标准曲线中查得待测样品中sTNF-α含量。 【试剂及配制】 （1） 包被抗体McAb1 ：使用时用包被液作适当稀释（如1：100）。 （2） 酶标抗体McAb2 ：以辣根过氧化物酶（HRP）标记。使用时用稀释液作适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定。 （3） rhuTNF-α标准品：已知含量的rhuTNF-（10ng/ml），使用时用稀释液作倍比稀释成7个浓度：5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，625pg/ml，312 pg/ml，15

FACS 法检测样品mTNF 【基本原理】 利用荧光标记的抗TNF McAb的免疫荧光技术和激光激活原理，通过FACS（荧光激活流式细胞分离术），即可对膜表面结合有TNF的单核/巨噬细胞进行定性或定量分析与分离。 【材料和试剂】 （1） 制备好的单核/巨噬细胞悬液 （2） 含2%人血清、0.1%叠氮钠的PBS及PBS （3） FITC（异硫氰酶荧光素）标记的抗TNF McAb （4） 兔抗TNF多克隆抗体 （5） FITC标记的羊抗兔IgG （6） 圆底96孔细胞培养板，离心机，温浴箱，刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），CO2 培养箱，流式细胞液，细胞计数板 【操作步骤】 （1） 将单核/巨噬细胞加或不加激活剂，37℃，5%CO2 培养箱中培养一定时间； （2） 将单核/巨噬细胞悬液以2000r/min离心10min， 弃上清； （3） 用含2%人血清10.1%叠氦钠的PBS重新

双抗体夹心ELISA法检测待测样品sIL-2R含量 【基本原理】 选用两株针对sIL-2R分子不同位点的单克隆抗体，即McAb1 （包被抗体）与McAb2 （酶标抗体）。先用McAb1 包被固相载体，使待测sIL-2R与之特异性结合，然后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的McAb2 ，则形成McAb1 -sIL-2R-HRP标记McAb2 复合物，再加入HRP底物（邻苯二胺），则酶催化底物而显色，测定样品与标准品OD值，绘制标准曲线，即可从标准曲线中查得待测样品中sIL-2R含量。该法敏感性高，且特异、简便、快速、取材容易，故较为常用。 【材料和试剂】 （1） 包被抗体（McAb1 ）：使用时用包被液作适当稀释（如1：100）。 （2） 酶标抗体（McAb2 ）：以辣根过氧化物酶（HRP）标记。使用时用稀释液做 适当稀释，其稀释度根据预试验结果而定。 （3） sIL-2R标准品：已知含量的sIL-2R，使用时用稀释液作倍比稀释成7个浓度：1600u/ml， 800u/ml， 400u/ml， 2

ELISA 抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量 【基本原理】 本法是用纯化或重组的IL-2R(α链，P55，CD25，Tac抗原)蛋白包被96孔酶标反应板，同时加入已知量的抗IL-2RMcAb，再分别加入sIL-2R标准品与待测样品。则待测sIL-2R或者sIL-2R标准品与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白竞争与抗IL-2R McAb结合。通过与标准品对照，从抗IL-2R McAb与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白结合受抑制程度来求得待测样品中sIL-2R含量。 【材料和试剂】 （1） 纯化或重组的IL-2R蛋白（α链，P55，CD25，Tac抗原）（40.000u/ml） （2） FITC标记的抗IL-2R McAb（0.2μg/ml）：FITC为异硫氰酸荧光素，这里仅作为半抗原使用，而不作为荧光素标记。 （3） 碱性磷酸酶标记的兔抗FITC抗体（酶标抗体） （4） 对硝基苯磷酶盐底物液；用pH9.8的二乙醇胺缓冲液溶解，配成浓度为1mg/ml。 （5） 1

间接免疫荧光法检测样品中mIL-2R α + 阳性细胞 白介素2受体（interleukin 2 receptor， IL-2R）是能与白介素2（IL-2）特异性结合的细胞受体。IL-2R由α、β、γ链组成。IL-2R存在形成包括膜结合型IL-2R（membrane-bound IL-2R，mIL-2R）与可溶性IL-2R（solubble IL-2R，sIL-2R）。sIL-2R是由于某种因素（如位点特异性蛋白酶裂解作用）使mIL-2R α链（P55，CD25，Tac抗原）脱落进入体液而形成，（是mIL-2R的清除形式之一）。体液中sIL-2Rα升高是抗原强烈刺激的标志以及T淋巴细胞活化的标志。sIL-2R由mIL-2R+ T细胞释放，可存在于血清、尿液及淋巴细胞培养上清液中。应用标记的抗IL-2R特异性抗体和抗原抗体反应可检测待测样品中sIL-2R含量，也可检测mIL-2R。目前多以双抗体夹心ELISA法或ELISA抗原竞争法检测sIL-2R含量，以间接免疫荧光法或放射免疫法检测mIL-2R。 【基本原理】 利用抗IL-2Rα McAb(

IL-2 质粒DNA探针制备的操作步骤 （1）含IL-2质粒DNA探针的提取 取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基（含100μg/ml Amp） ↓37℃ 220r/min 振摇过液(约16h ) 取10ml菌液加200ml LB培养液(含100μg/ml Amp) ↓37℃ 150r/min振摇 4h 加氯霉素(终浓度170μg/ml) ↓37℃ 220r/min振摇3h 菌液倒入300ml离心管中离心 ↓4℃ 5000r/min×10min离心弃上清除去残液(吸水纸无菌) 每管加40ml STE溶液(冰预冷)悬浮细菌后，用移液管转入到50ml离心管中 ↓4℃ 5000r×15min离心 弃上清，加5ml溶液1(冰预冷)悬浮细菌，加1 ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10g/ml) ↓轻摇，室温静置5min 加10ml溶液II，盖上盖子，将离心管小心颠倒数次混合液体，不要用旋涡振荡器 ↓冰浴10min，且勿摇动 加7.5ml溶液III(冰预冷)摇振荡离心管数次使之混合 ↓冰浴2

IL-2 DNA探针的标记 地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的类固醇半抗原，又称异羟基洋地黄毒甙配基，地高辛精可以通过一个11个碳原子的连接臂与尿嘧啶核甘酸嘧啶环上的第5组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶甘酸:Boehringer Mannheim公司出售的地高辛精标记核苷酸有dig-UTP，dig-dUTP和dig-dduTP，它们分别适用于RNA探针、DNA探针和寡核苷酸探针的标记。地高辛精标记核甘酸主要通过酶反应标记核酸探针，用标记探针做原位杂交，杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。在适宜的标记反应条件下，一般在20-25个核苷酸中带有一个标记的核苷酸。这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛精之间的反应。因为一个标记抗体大约覆盖20个核苷酸。Boehringer Mannheim公司生产的地高辛精DNA标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛。【试剂与仪器】（1） 地高辛标记和检测试剂盒（Boerhinger Mannheim，No1093657）：其中包括六聚核苷混合物，dNTP混合物，Klenow聚合酶等（2） 乙醇，LiC

原位杂交法测定TNF的mRNA 原位杂交 【试剂及配制】 （1） TNF-DNA探针 （2） 地高辛标记液试剂盒 （3） 杂交液：60%去离子甲酰胺，300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2 PO4 (pH7.4)，5%葡聚糖硫酸酯，250μg/μl变性鲑精DNA （4） 设备：温箱，水浴锅，加样器，吸头，染色缸等 【操作步骤】 （1） 用地高辛标记DNA探针，参见上面介绍的“斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量”； （2） 准备杂交液； （3） 临用前，将DIG标记的DNA探针在80℃加热10分钟，迅速置冰浴中变性后，将其加入杂交液中，至终浓度5μg/μl； （4） 将10-20μl杂交混合液（杂交液加变性探针）加入到固定并增加了通透性的细胞上，盖上专用原位杂交盖玻片，放入盛有约20ml 20%甘油湿盒内37℃使其杂交过液

瑞氏（wright）染色法检测细胞凋亡 【材料与试剂】 Wright染液：称取Wright粉剂0.1g在碾钵内，充分碾磨，量取甲醇60ml，逐步加入，边加边碾磨，直到染料全部溶解，置试剂瓶中密封，1周后可用。 Wright磷酸盐缓冲稀释液：Wright染液10 ml，磷酸盐缓冲液20ml。 磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾6.63g，磷酸氢二钠2.56g，蒸馏水1000ml。 染色缸，离心涂片机，离心机，显微镜。 其它：甲醇，0.08%醋酸，中性树胶。 【操作方法】 收集细胞（1×106 ），PBS洗1次； 将以上细胞涂片或用离心甩片机制成细胞甩片； 用甲醇固定3～5min； 将标本玻片插入 Wright染液缸中染色2 min； 再插入Wright磷酸缓冲稀释液染色4～10min，用蒸馏水冲洗。如果颜色太深，可用0.08%醋酸分化数秒钟； 晾干，用中性树胶封片； 【结果判断】 正常细胞核染成深蓝色或蓝紫色，色泽均一，凋亡细胞可见核固缩，破碎，染色变深，细胞膜皱缩，出泡，出现凋亡小体。 （三）Giemsa（姬姆

Hoechst/PI 双标记法检测细胞凋亡 凋亡细胞在等渗条件下进行活细胞染色，其吸收Hoechst的能力增强。因此，在活细胞中加入Hoechst染料，凋亡细胞很快产生较强的蓝色荧光，其强度要比坏死的和活的细胞大得多。Hoechst/PI双标记法是目前细胞凋亡最满意的形态学分析方法。先用Hoechst进行活细胞染色，再进行PI染色，并与细胞光散射性质测定结合起来。Hoechst/PI双标记法也适用于不发生DNA断裂的凋亡细胞的测定。 【材料与试剂】 Hoechst 33342储存液（0.1mg/ml）：配制方法同上述。 PI储存液（1mg/ml）：配制方法同上述。 PBS 培养细胞或离体细胞制成的单细胞悬液。 【操作方法】 将106 个细胞悬浮于1ml培养基（含10%小牛血清）中，加入10μl Hoechst33342储存液，混匀； 置于37℃温育5～15min； 将细胞置于冰上冷却后，于4℃离心，去除上清； 将细胞重新悬浮于1ml PBS中，加入5μl PI储存液，混匀，37℃复染10~15mi

凋亡早期，细胞表面可发生改变，细胞膜的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从胞膜内转移到胞膜外层，从而使 PS 暴露在细胞表面。在凋亡发生时，巨噬细胞能特异性识别暴露在细胞表面的PS，从而吞噬凋亡细胞和凋亡小体，使机体免于细胞内容物释出所引起的炎症反应和伴有的组织细胞坏死。Annexin-V 是一种 Ca2+ 依赖性的磷脂结合蛋白，与 PS 有高度亲和力。因此该蛋白可以作为一种敏感的探针，用以检测暴露在细胞膜外层的 PS，故适合凋亡细胞的检测。由于坏死细胞失去膜的完整性，PS 也会暴露，故必须区分凋亡细胞与坏死细胞。用一种 PI 染料做染色排斥实验，就可以从 Annexin-V 染色阳性细胞群中区分出坏死的细胞。在荧光显微镜下观察，正常细胞无任何荧光标记；凋亡细胞膜上染有黄绿色光环；坏死细胞膜上染有黄绿色光环，胞核被 PI 染成红色。 一、材料与试剂（1）Annexin-V-FLUOS Staining Kit：Annexin-V-Fluorescein （瓶 1）Propidium iodide （瓶 2）Binding Buffer （瓶 3）标记液的配制（用于 10 份试验）：将 20

基于凋亡诱导蛋白酶变化的细胞凋亡检测 半胱-天冬氨酸蛋白酶家族（cysteinyl aspartate specific protease，Caspase）是近几年人们发现的与ced-3同源的一类蛋白酶，具有10余种成员。“C”代表半胱氨酸在酶的活性中心，“aspase”代表其底物切割蛋白作用位点都在天冬氨酸羧基端，这是caspase家族最为独特的催化活性。Caspase一般以非活化的酶原形式广泛存在于大多数细胞中，研究认为，一些caspase家族成员可在凋亡中被活化，继而活化其他的caspase，产生放大级联反应并切割底物，从而介导凋亡的极早期发生过程。例如caspase家族成员之一caspase 3在某些特定效应分子（尤其是TNF和Fas）诱导的细胞凋亡中是必不可少的。 由于caspases家族可能是启动生化过程从而导致凋亡的最为重要的效应分子之一，因此对caspase活化的分析较其他常用的方法更能检测出凋亡的早期发生。Caspase可以切割多种重要底物， PARP是其中之一。PARP的裂解是细胞凋亡发生最有价值的标志，可以通过Wes