【原理】 1 ．质粒 DNA 的提取与鉴定原理 细菌质粒是一类闭环双链的 DNA 分子，独立于细胞染色体之外，在细胞质中 具有 自主复制能力且可稳定遗传，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具 — 载体。从大肠杆菌中提取质粒 DNA ，是一种分子生物学最基本的方法。分离制备质粒 DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、 SDS 法、羟基磷灰石层析法等，在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。分离质粒 DNA 的方法总体包括 3 个步骤： ① 培养细菌，使质粒 DNA 大量扩增； ② 收集和裂解细菌； ③ 分离和纯化质粒 DNA 。 本实验采用碱变性法微量制备质粒 DNA 。其基本原理是在 NaOH 和溶菌酶破除细胞壁后，使 DNA （包括质粒 DNA 和基因组 DNA ）释放出来。在强碱条件下， DNA 变性成单链，当加入醋酸钾溶液（ pH4.8 ）适当中和 pH 时，质粒 DNA 能很好地复性，而基因组 DNA

一．实验目的 掌握通过物理手段中断细菌接合作用的方法，并且进行基因定位。 二． 实验原理。 在大肠杆菌细胞内，F因子可以插入到宿主细胞的染色体DNA中，带有一个整合F因子的细胞称为Hfr细胞。不同的Hfr菌株中F因子整合的位置都不尽相同。当Hfr细菌与F-接合时Hfr细胞的染色体可以进入F-细胞，发生重组。Hfr细菌中染色体的转移从F因子末端开始，而且在转移的过程中可随时发生中断。因此，接合后的F-细菌虽然接受了某些Hfr基因，但是一般不能接受F因子从而成为Hfr或F+状态。而由于染色体的转移具有方向性且随时中断，处在前端的Hfr基因有更多的机会出现在F-细菌中，越位于后端的基因转入F-细胞的机会就越少。因此，根据接合后F-细菌中Hfr基因出现的多少便可以知道这些基因转移的先后顺序，即基因在染色体上的排列顺序。 中断杂交便是依据这一原理设计的一种方法。和非中断杂交方法不同的是，中断杂交是运用机械的方法使Hfr和F-细胞的杂交在任何时间中断，这是一种以时间为单位的基因定位法，可以测得特定基因在染色体上排列的绝

一、 实验目的 1．了解细菌有性杂交的原理，学习合作实验，熟悉点菌。 2．掌握利用非中断杂交法进行基因定位的原理，并利用实验结果进行分析。 二、 实验原理 F + 菌株：带有F因子的菌株 F - 菌株：不带F因子的菌株 Hfr品系：F因子整合入细菌染色体 F’菌株：由Hfr菌株染色体中F因子的不正常环出造成F’因子含有供体细胞的特定基因 其中，带有F因子的菌株能够与不带F因子的菌株（F - 菌株）进行杂交进而发生基因重组。F因子一般游离于细菌染色体之外，也可能整合到染色体上，因此是一种被称为附加染色体的质粒。带有F因子的细菌，细胞表面会形成一种与细胞接合作用相关的毛状突起，被称为性纤毛，长约1-20μm。性纤毛促使供体和受体细胞特异地配对，在受体细胞上有纤毛的特异结合位点，当性纤毛结合到这些特异性位点之后，开始收缩并将2个细菌拉拢形成作为遗传物质转移通道的接合管，遗传物质的转移就开始了。 F + 菌株和F - 菌株杂交发生基因重组的频率

一、实验目的 1、了解植物DNA分离的原理与方法。 ２、掌握CTAB法大量分离植物DNA的方法与技术。 二、实验原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。将植物叶片在液氮中研磨，用CATB处理，用氯仿-异戊醇除蛋白质，便可分离到DNA。 三、实验材料 植物新鲜叶片 四、器具及药品 电子天平，研钵， 离心管 ，恒温水浴锅，冷冻离心机，冰箱，微型离心机，紫外分析仪，紫外可见分光光度计，微波炉，液氮，提取缓冲液[2%（w/v）CTAB，2% PVP（polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮），100 mmol·L -1 Tris-HCl，20 mmol·L -1 EDTA，1.4 mol·L -1 NaCl，pH8.0，灭菌后室温保存；用前加入巯基乙醇至终浓度为2%]，氯仿，异戊醇，TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）。 五

一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温 水浴 锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中

（一）实验目的 1、了解琼脂糖凝胶电泳的原理和使用范围。 2、了解琼脂糖凝胶电泳的操作技术。 （二）实验内容与基本要求 本实验用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，其主要内容包括制胶，加样，电泳，染色及拍照。 （三）主要 仪器 设备及器材 1、设备：电泳仪、水平式电泳槽、紫外线透射仪、凝胶成像系统。 2、器材：DNA 、琼脂糖、微量加样器、微量 离心管 、溴酚蓝。 （四）操作 1、琼脂糖凝胶的制备 以稀释的电泳缓冲液（0.5×TBE 溶液）为溶剂，用沸 水浴 或微波炉配制一定浓度的溶胶。将胶槽两端分别用透明胶紧密封住。将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。待溶胶冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5 微克/毫升的EB，摇匀，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却，撕去两端的透明胶，拨出梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面。 2、样品配制与加样 取2 μ

一、准备工作 1、缓冲液1×TSS的配制： 事先配制1M的氯化镁——20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。 取 干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g酵母抽提物，0.5g氯化钠，10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。储存在4度，保质期约6个月。 2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种——Dh5α，用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶，分别装有30 ml和50mlLB，灭菌后置于4℃冰箱备用。 3、若干已灭菌的 琼脂 平板，一个未加 抗生素 ，用于第二步的接种。其余做转化用。 二、感受态制备程序： 1、 前一天晚上调单菌落至30 mlLB中过夜培养（12-16h）,按1：100 比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50 m

试剂 配制： A 液：1M，MnCl2；mol/L B 液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌； C 液： 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口 试剂 瓶，然后加入46ml 三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。 TB 缓冲液： 方法步骤： 1、溶液配制取1 管B 液（0.6ml），全部加入C 液(46ml)中，混匀后，再用1ml 移液器加入3.3ml A 液，混匀冰浴即可使用。 2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h）， 挑取2-4 个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4 小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（328 rpms）培养， 3、其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB 缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮， 4、加入280ml DMSO（可用国产分析纯

最近市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、 美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的 SOLiD测序仪、Dover/Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪。所 有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法（cyclic-array sequencing），也可将其 称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。 所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的 聚合酶 反应（模板变性、 引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。2005年，有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍。与传统 测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。 图1 传统的Sanger测序法及新一代DNA测序技术工作流程图。 （a）高通量

AB SOLiD测序仪可以对由任何方法制成的DNA文库进行测序。AB SOLiD测序仪有一个极大的特点就 是能够将富集模板片段的微珠在芯片上进行高度可控的任意排列。AB SOLiD测序仪也是使用如图5a中所示 的微乳液PCR方法扩增模板片段的，不过，它这里使用的是直径只有1μm的小磁珠。PCR扩增反应结束之 后，微乳液滴被打破，小磁珠被富集起来固定到固态平板上，制成高密度测序芯片。后面的合成测序法由 DNA连接酶而非DNA 聚合酶 完成。 首先，通用引物与模板片段两端的接头序列互补结合，然后连接酶将一个被荧光标记的8bp长的核酸探 针片段（fluorescently labeled octamers）连接到引物末端（图6c）。这段8bp长的核酸探针片段是经过设计 的，比如其中第五位碱基上就标记了荧光。连接反应完成之后，就可以采集荧光图像，然后在第五位碱基和 第六位碱基之间切断，去掉荧光标签。如此反复，就可以获得每间隔四个碱基的第五号碱基的确切信息，比 如第5号碱基、第10号碱基、第15号碱基以及第20号碱基等等。经过几轮这样的循环之后，已经获得延伸的 引

HeliScope测序仪是由Quake团队设计开发的，它实际上也是一种循环芯片测序设备。不过，HeliScope 测序仪最大的特点是无需对测序模板进行扩增，它使用了一种高灵敏度的荧光探测仪直接对单链DNA模板进 行合成法测序。首先，将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子，并且在每个片段末端加上poly-A尾。然 后通过poly-A尾和固定在芯片上的poly-T杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片。最后借助聚合酶 将荧光标记的单核苷酸掺入到引物上（图6d）。采集荧光信号，切除荧光标记基团，进行下一轮测序反应， 如此反复，最终获得完整的序列信息。根据最近的报道，经过数百轮这种单碱基延伸可以获得25bp或更长的 测序长度。HeliScope测序仪的其它特点见表6。 图6 循环芯片测序技术示意图。 （a）454测序仪使用的方法，经微乳液PCR法扩增后，携带有大量模板分子的微珠被放置到芯片上的微孔中。随 后使用焦磷酸法测序，每一轮测序反应都会掺入一个核苷酸，随后加入反应 试剂 荧光素和5'腺苷酰硫酸，这样在 每一个小孔中每当有

核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为： 裂解细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 沉淀核酸 纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质 ( 一 )DNA 提取的经典方法 DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。 说明： 回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。 沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。 70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。

[摘 要] DNA测序技术作为现代生命 科学研 究的核心技术之 一，自上世纪 70年代 中期 DNA发 明以来发展迅速 。我 们简要综述现有的几代 DNA测序技术的原理及其发展历程 ，并对未来可能出现 的第三代测序进行预测。 [关键词 ] DNA测序；新一代 测序 ；单分子测序 ；直接测序 The Overview ofDNA Sequencing Technology ZHAN Ai-Yao，LUO Pei-Gao College ofAgircultural，Sichuan AgriculturalUniversity，Ya'an 625014，China [Abstract] DNA sequencingtechnologyasoneofthecoretechnoloyg ofmodem lifescienceresearchhasquickly developed since itsestablishing，the mid一1970s．In thisarticle we mainly summairzed the curre

质量的eoDNA更是探究结果准确性的保证。目前, 对于eoDNA的获取, 使用的方法主要有: 苯酚–氯仿 抽提法、微柱吸附法、磁珠吸附法。 Fleischhacker等[55] 比较了三种 试剂 盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit from Qiagen, NucleoSpin Kit from Macherey-Nagel, MagNA Pure isolation system from Roche Diagnostics)获取eoDNA的效率, 认为DNA富 集方法在定量检测中起到很重要的作用。Yuan等[80] 用改良苯酚–氯仿法富集eoDNA, 高效地检测到eoDNA 中的EGFR(epidermal growth factor receptor), 且其检 出率要高于微柱吸附法 试剂 盒。Chen等[81] 研究表明, 传统苯酚–氯仿法虽收集的DNA纯度不是很高, 但 是DNA的含量相对高纯度PCR模板制备试剂盒和单 细胞PCR要高得多, 是相对最有效率的提纯方法。 严子禾等[82] 比较了传统苯酚–氯仿法、微柱吸

用非常规的逆向方法，可迫使酵母遗传筛选中的蛋白质相互作用，研究者由此可以鉴别出参与 生物 反应过程的因子。 将传统方法倒转过来使用，有时会产生令人意想不到的结果。在华盛顿大学Stanley Fields实验室工作的Michael DeVit，当研究蛋白质之间相互作用的效果时，就遇到上述这种情况。双杂交筛选法可筛选出结合诱饵蛋白的蛋白质，DeVit 和Fields两人将这种方法倒转过来使用：他们先迫使蛋白质与诱饵结合，然后再筛选可以激活某一反应通道的蛋白(DeVit等人，2005)。事实证明，这种方法非常适合分离某些 生物 反应过程(如信号转导)中的成份 这种方法的第一步是迫使蛋白质之间相互作用，从技术上来讲，这也是最具挑战性的步骤。DeVit选用了转录激活子Jun和Fos的亮氨酸拉链序列(该序列相互之间结合具有高度亲和性)，将一段序列与他的诱饵结合，另一段序列与他的酵母蛋白文库结合。在这一体系的首次试验中，他将Jun-GFP作为诱饵，并将其与Fos蛋白文库结合。随着GFP在细胞中定位，DeVit可以识别目标蛋白的胞内位点。

1.了解光学显微镜的构造、成像原理及其使用方法。 2.学习临时装片及绘制生物图的方法。 [材料用品] 材料：水绵营养体 用品：显微镜、载玻片、盖玻片、小烧杯、滴管、尖咀镊子、滤纸条、。 [方法与步骤] 一、光学显微镜的结构 基本结构可分为两个部分： （一）显微镜的光学部分 1.目镜：由二、三片透镜组成，安装在镜筒上端，也叫接目镜。在目镜上方刻有5×、10×、20×等为放大倍数。从外表上看，镜头越长放大倍数越低。 2.物镜：由数组透镜组成，安装在转换器上，又称接物镜，每台显微镜上常备有几个不同倍数的物镜，物镜上所刻8×、10×、40×等就是放大倍数，习惯上把10－20倍的叫做低倍物镜；40－60倍的叫做高倍物镜；90－100倍的叫做油镜。从形态上看，接物镜越长，放大倍数越高。 显微镜的放大倍数，粗略计算方法为接目镜放大倍数与接物镜放大倍数的乘积。如观察时所用接物镜为40×、接目镜为10×，则物体放大倍数为40×10＝4

一、目的要求：掌握显微量尺的使用和测量细胞大小的方法。 二、实验用具：显微镜、显微量尺、镊子、解剖针、载玻片、培养皿、滴管、碘液、擦 片纱布。 三、实验材料：洋葱。 四、实验内容： （一）、目微尺和台微尺： 显微量尺是在显微镜下，用来测量观察材料大小、长短的一种工具，有目微尺（目镜量尺）和台微尺（载物台量尺）两部分。 目微尺：为一园形玻片，中央长１cm的部分有极为精确的平行刻度（５０格或１２０格）。 台微尺：为一块特别的载玻片，中央装有一园形盖玻片，其上也刻有精细刻度，通常为１mm，精确等分为１００格，每格等于１％mm，即１０微米（μ）。 （二）、显微量尺的使用步骤： （１）、计算目微尺每一格的数值：在测量标本前，必须标好目微尺一格在低倍镜、高倍镜和油镜下各为多少。先将目微尺放入接目镜镜筒内，方法如下：取下接目镜，摘下目镜透镜，把目微尺放入接目镜镜筒内光栏上，再装上接目镜。在视野中可看到刻度，每隔１０格有一阿拉伯字母，如１０、２０、３０......１００。注意字母是正面还是

S.R Young, M. Dyson和 P. Boltin 美国盖氏与圣汤姆斯医院的内科和牙科学校(盖氏校园)解剖部门的组织修复研究单位与盖氏医院英国伦敦桥，SE1 9RT 利用45Ca放射性元素技术来研究U937细胞受光线照射后钙吸收之效果。当细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中时，加以光照处理、能量密度、脉动频率和波长变动的效果加以调查后。结果显示被细胞吸收的钙，取决于光源的能量密度。钙吸收的增加为0~4J/c㎡，但之后当能源密度增加到16J/c㎡，就开始稳定的减少，当能量密度达到最大的测试量32J/c㎡时，所维持的这个水平和控制组的水平并无大差异，也显示钙的吸收取决于频率和波长上。频率测试最有效的范围是16-36.48Hz。波长测试则最有效为660、820和870 nm。细胞内钙的改变标准响应着光照治疗，这也许有相当的 生物 的和临床的重要性，因为钙离子担任许多细胞活动的第二媒介的传达者，包括合成、分泌和细胞内的沟通。 关键词： 45Ca、能量密度、纤维组织母细胞、光线治疗、巨噬细胞、脉波频率、 波长 介绍 从1970年早期，Mester的开创

电镜样品取材方法 1　动物及人体组织的取材 动物组织的取材，应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1㎜宽，2～3㎜长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成１㎜3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（0～4℃）。 2　体外培养细胞的取材 生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着到入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置3～5min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将含有细胞的固定液转移到离心管中，普通离心机低速离心（2000转/分钟）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。 3 植物组织的取材 植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不象动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜切成薄片状

（一）材料与 试剂 1．新城疫灭活油 佐剂 苗 2．患传染性法氏囊炎的法氏囊组织 3．传染性法氏囊炎弱毒苗 4．健康产卵鸡群 5．新城疫血凝抗原 6．传染性法氏囊炎琼扩抗原 7．其它 （二）操作方法 1．传染性法氏囊炎组织灭活苗的制备 将有病变的法氏囊组织称重，以组织捣碎器捣成匀浆，按1︰5（重量︰体积）加灭菌生理盐水，继续捣匀，然后用5层灭菌纱布过滤，加入0.30％的甲醛，混匀，37℃感作24h，中间振荡数次。灭活后，以常规培养基进行杂菌检查，以小白鼠进行安全检查，合格后，置阴凉处备用。 2．传染性法氏囊炎灭活油 佐剂 组织苗的制备 将10号白油按2％加硬脂酸铝粉和6％的司本－80混合加热融化后，分装保存。灭活组织液以4％比例加入吐温80，以油相︰水相＝3︰1的剂量制成灭活油佐剂组织苗。先将油相搅拌起来，逐渐加入水相，充分搅拌即可。 3．选取健康无主要传染病，特别是无鸡白痢、沙门氏菌病的高产鸡群。 4．将鸡新城疫灭活油佐剂苗与