用于荧光定量PCR仪的化学染料有多种，包括SYBR Green I、分子 Beacons、水解探针(TaqMan 探针)、ScorpionsTM 探针和AmplifluorTM系统。也可完成实时量化和DNA解链曲线。 SYBR Green I SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。 SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1。由解链曲线来分

一．原理 PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中，Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA片断选择性地吸附到silica膜上。经Buffer W1、Buffer W2洗涤去除残留在silica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到silica膜上的DNA片断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。 二．材料与方法 1 材料 PCR产物 2 仪器 、用具 恒温孵育器（65℃）、离心机、移液器、1.5ml 离心管 3 试剂 Buffer PCR-A；Buffer W1；已加无水乙醇的Buffer W2；Eluent或去离子水 4 方法 (1) 在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer

应用定量PCR技术，用一种标准作对照能够估计出一种特异性靶DNA或RNA分子的相对含量。 参照物： 在定量PCR 中必须加入参照物，用来作为扩增系统的阳性对照，并作为未知样本定量的标准，且通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率，使其具有可比性。参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。 内参照和外参照均是在定量PCR 过程中一种含量已知的标准品模板。根据参照物的不同，定量PCR分为竞争性定量PCR和非竞争性定量PCR。内参照是与待检样本加于同一反应管中，与样本共用或不共用同一对引物的标准模板。共用同一对引物者，两个模板的扩增存在竞争性，称竞争性内参照，这种条件下进行的定量PCR属竞争性定量PCR；相反，不共用同一对引物时则不存在竞争性，为非竞争性内参照，属非竞争性定量PCR。 外参照则是参照物与待检样本的扩增分别在不同的管间进行。采用外参照进行的定量PCR属非竞争性定量PCR。 非竞争性对照基因定量法： 即是靶基因与参照基因的同步扩增。是在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同

主题词　乙型肝炎病毒；DNA，病毒/分析；聚合酶链反应 中国图书资料分类号　R512.62 摘　要 目的　利用竞争PCR法建立分级测定HBV DNA含量的定量方法. 方法　设立3个标准竞争模板(10 2 cop, 10 4 cop, 10 6 cop)，分别和恒量的待测模板混合，分别进行40，30，20次循环的PCR扩增，最后凝胶电泳分离待测模板和竞争模板的PCR产物，测定两者的荧光强度的比值，计算待测模板的初始量. 结果　对乙型肝炎血清HBV DNA定量表明，12份HBeAg阳性血清，HBV DNA的血清浓度在6×10 7 ～1×10 11 cop/L，而12份HBeAb阳性血清只有7份可检出HBV DNA，它们的血清浓度均在3×10 8 cop/L以下，其余5份用该PCR方法，检测不到. 结论　该方法可用于HBV DNA以及其他病原体DNA的定量. Grading quantitative PCR

菌落 PCR（Colony PCR）可不必提取基因组 DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者 DNA 测序分析。最后的 PCR 产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。 具体方法：1、PCR 混合物的制备Taq buffer（10×） 20 uldNTP（2.5 mM） 5 ulPrimer Forward（50 mM） 10 ulPrimer Reverse（50 mM） 10 ulddH 2 O 147 ulTaq（2U/ul） 8 ultotal 200 ul将上述溶液混匀，10 ul 每管分装于 200 ul PCR 管中。 2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在 LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装 有PCR混合物的 PCR 管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是 1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。 3、将混有菌体的 PCR 混合物置于 PCR 仪中，按常规条件

蒋　敏1 , 贾文祥3 , 陈　岚1 , 周　伟1 , 李文胜1 , (1. 四川大学华西第二医院, 四川成都610041 ; 2. 四川大学华西医院, 四川成都610041 ; 3. 四川大学华西基础医学与法医学院, 四川成都610041) 摘要: 目的　建立一种多重PCR 方法,在同一扩增体系内同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因, 探讨采用多重PCR 同时检测淋菌及其耐药基因的可行性。方法　根据淋菌CPPB、TeM21、Tet2M基因序列,分别设计了3 对引物,并在同一扩增体系内行PCR 扩增,扩增的靶序列分别为150 bp 、224 bp 、316 bp 。结果　淋菌及其青霉素、四环素耐药的标准菌株,上述3 个基因位点的检测均为阳性,对125 例临床标本同时进行传统培养、药敏和多重PCR 检测,结果显示淋菌的检出率:培养法为20. 0 % ,PCR 法为24. 8 %;PPNG检出率:药敏法为16. 0 % ,PCR法为20. 8 ;TRNG检出率:药敏法为14. 4 % ,PCR 法为19

　PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 　　为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-S

　　一、PCR操作范例 　　在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg 2+ 和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA 试剂 盒提供的典型反应条件供参考。 表22-1 PCR反应混合液 成分 加入体积（μl） 最终浓度 双 蒸馏 水

　　PCR反应条件三要素为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间

凝胶纯化PCR扩增的靶序列 如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离: 1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离。 2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。 3.加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。 4.取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。 5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。 当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或 重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后 电

单个二倍体细胞 在分析单精子以前，Li等人对个体二倍体细胞内的β珠蛋白基因进行过研究。两 个组织培养细胞株用于这些实验。其中一个纯合是镰刀型细胞密码子6（βS）发生突 变，另一个纯合子则来源于正常的βB等位基因。扩增含有密码子6的β珠蛋白片段的 引物，及能够区别这两个特异的等位基因的寡核苷酸探针（ASO）已经报道过。βA纯 事细胞和βB纯合细胞和βS纯合细胞在同一组织培养瓶中共同培养数天。将用相差显 微镜观察到的混合培养的单个细胞转入溥塑料胡管内。分别将单个细胞转入含裂解液 的PCR管中，保温后，加入PCR缓冲液，缓中有四种dDNP．Taq DNA聚合酶和扩增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分钟变性靶DNA，然后根据已发表方法的改进方案进行 50全循环的扩增。通过打点杂交，等量的扩增产物打点于尼龙膜后，扩增产物分别与 βA和βS的探针杂交。所分析的37个细胞中，84％细胞只与βA和βS探针杂交，杂交 强弱各不相同；19个与βA探针．12个与βS探针杂交。12个以水作空白对照的反应管 中瓜呈阴性，它表明忽略不记DNA的污染。没有与两种探针都杂交的样品，它暗

[ 实验原理 ] 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术是美国Cetus公司人类遗传研究所的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法。PCR具有很高的特异性、灵敏度，在分子生物学、基因工程研究、某些疾病的诊断以及临床标本中病原体检测等方面具有极为重要的应用价值。 双链DNA分子在接近沸点的温度下解链，形成两条单链DNA分子（变性），与待扩增片段两端互补的寡核苷酸（引物）分别与两条单链DNA分子两侧的序列特异性结合（退火、复性），在适宜的条件下，DNA聚合聚利用反应混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP），在引物的引导下，按5’-----3’的方向合成互补链，即引物的延伸。这种热变性、复性、延伸的过程就是一个PCR循环。随着循环的进行，前一个循环的产物又可以作为下一个循环的模板，使产物的数量按2 n 方式增长。从理论上讲，经过25-30个循环后DNA可扩增10 6 -10 9 倍。 除上述典型的PCR

错配PCR-限制性片段长度多态性分析检测HBV前终止密码变异株 技术的建立及临床应用 周伯平 徐六妹 王火生 付涌水 李卫宁 韩红星 马为民 袁 静 深圳市东湖医院 深圳市肝病研究所 518003 摘要 采用错配聚合酶链反应(mpPCR)对HBV前C区基因进行扩增，对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP)，鉴定前C区第83位核苷酸点突变。并对PCR产物进行核苷酸序列分析以鉴定其特异性。通过对不同含量HBV DNA&127;的阳性血清检测结果显示本法可检出10 5 copies/ml的HBV DNA，测序结果证实PCR产物为HBV前C区特异性序列，与RFLP分析结果相符。采用mpPCR-RFLP对74份慢性乙型肝炎患者血清进行检测，结果17例前C区终止密码变异(23%)，其中8例抗-HBe&127;阳性的变异株感染者有1例为慢性重症肝炎；5例肝功能反复异常，提示多数前C区变异株HBV感染者伴有活动性肝病。采用本法检测前C区变异株HBV感染，操作简单，特异性与敏感性好，试验结果稳定，适用于临床推广

一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性： 　　通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA 聚合酶 ，具有完整的3’外切酶校读活性（3’-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由1undefined-4降到1undefined-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA 聚合酶 Ｉ Klenow片段）或AmpliTaq（全长的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。因而以往的PCR反应产物限制在5.0kb以内。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。 利用两种DNA聚合酶进行较大片段D

PCR法和 14 C呼气试验检测幽门螺杆菌的比较 临床检验杂志 1999年第1期第17卷 临床微生物学与寄生虫 作者：杨学文　王礼文　缪界平　陈亚军　陈云峰 单位：江苏省中医院，南京210029 关键词：聚合酶链反应； 14 C呼气试验；幽门螺杆菌 　　 摘要 　用聚合酶链反应(PCR)和 14 C呼气试验( 14 C-UBT)对66例上消化道疾病患者进行幽门螺杆菌(Hp)检测，结果PCR检出率为69.7%， 14 C-UBT检出率为71.2%，PCR、 14 C-UBT两种方法诊断Hp感染的敏感性均为100%，特异性分别为95.2%和90.5%，精确性分别为98.5%和97.0%；慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎Hp检出率分别为77.8%和65.0%，两者无显著性差异；Hp感染无性别差异。研究结果表明， 14 C-UBT和采用自制的采样器获取胃粘膜组织进行PCR检测Hp均具

1．缓冲液 标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl ， pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶 的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有时使用 Mn2+ 。一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。 2．脱氧核苷三磷酸（dNTP） 脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。 3．引物 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml ， 在 100 μl 反应体系中相当于6x10 13 个分

凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一、琼脂糖凝胶电泳: 　　琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连 接等. (一)凝胶浓度 　　凝胶浓度的选择依DNA分子的大小而定. 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7

分子生物学在医学领域中的应用越来越广泛，基因突变在肿瘤和遗传病的发生过程中的作用也日益受到重视，因此检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)也成为了分子生物学，医学遗传学以及肿瘤学研究 中的热点。 基因突变（(gene mutation)是癌基因激活，抗癌基因失活以及遗传病发生的原因，从广义上讲，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变等三种形式，后两种基因突变涉及的基因较多，可以通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中 期的染色体来检出.也可以在细胞的有丝分裂间期用标记探针检出，而点突变涉及的范围较少，是肿癌和遗传病发生的主要分子机制，是基因分析的主要研究内容.一般来说，基因突变的检测方法包括：应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。 利用核酸探针及Southern印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制难以满足这际工作的需要，自从PCR技术问世以来，建立于PCR技术基础上的突变基因检测技 术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得极微量的组织 亦可经PCR扩增而进行中种检测

　　假设一个男性杂合子有两个连锁基因座。每一个基因座的多态性差异在于AT-AT 或GC-GC)要么是重组型(AT-GC或GC-AT)。重组类型出现的频率将取决于两个基因座彼 此间的遗传间距。通过检测某一个体的大量精子，可精确地计算出四种精子类型出现 的频率。该技术存在的困难在于确定减数分裂前细胞中的每个基因座上存在的两种等 位基因中的哪一个进入单个精子。常规的分子 生物 学技术没有足够高的灵敏度分析精 子染色体DNA的单个分子。 　　PCR扩增每个基因座的多态性区域是分析精子的第一步。两个基因座用两组引 物，同时引物必须位于多态性区域的边侧。当精子两个靶序列经PCR扩增，就确定了 每个基因座的等位基因成份。人工合成的寡核苷酸探针可识别等位基因小到仅发生单 个碱基置换的实验方法已得到改进，这些等位基因牧场划的寡聚物（ASO）探针第一 次应用是将人正常β珠蛋白基因中的正常βA等位基因与镰刀形红细胞（βA）的突变 区分开来。本方法检测等位基因需要人工合成的小片段寡核苷酸（典型的长19bp)。 每个寡核苷酸与一个等位基因完全互补而与另一个等位基因

高等生物遗传图谱的构建依赖于选择性杂交后代的分析或者通过家系分析法来计 算连锁关系。对人类而言仅后者是可行的。使用长度多态性限制片段（RFLPS）在构 建人连锁图谱方面已取得长足的进步。为了对带有与已知表现型相关的RFLP标记的基 因进行定位，首先得建立间隔约10CM的遗传标记束（平均1CM等于1％重组），这样没 有基因离标记RFLP的距离会超过5CM。可靠的统计表明家系分析能够检测的遗传间距 精确到1cM(1cM相当于1000kb的DNA。分析更小的遗间距需要检测家族内大量的个体， 而这实际上是行不通的。 　　最近发展了一种不依赖遗传交叉或家系分析的方法检测遗传标记间的重组频率。 具体方法是直接决定配子(精子)的基因型是亲本型还是重组型。这通过确定两个等位 基因中哪一个存在于双杂合男性精子上的两个基因座点其中之一来完成。根据上述方 法确定的重组精子的数量被总检测精子数除就可估计出重组频率。已知聚合酶反应在 体外扩增基因能够使DNA扩增10 9 倍，因此该技术有可能分析精子中单分子靶DNA。以 这种方式研究数千个人精子就有可能构建比家系分析要精确得