八十年代以来由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其严重的危害性而受到人们高度重视，力争早期诊断和寻求有效治疗是防止其广泛传播的关键所在.聚合酶链反应(PCR)具有敏感、特异和快速的特点，是检测病毒、评价病情进展和探讨发病机理的有效工具. 一、HIV的基因结构 　　HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，其单链RNA分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因。第一组为逆转录病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等.其中前三者为病毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的LTRs，不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性.第二组为调节基因表达的基因，即tat、rev和nef基因，可以增强或抑制其它基因的表达.第三组为特有基因，负调控病毒的感染性，成熟或释放，即vif、vpu和vpr.HIV有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异，事实上，独立分离到的HIV-1和2彼此都不

DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990 年，Williams 和 Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性 DNA 片段作为分子标记，并将此方法命名为 RAPD（random amplified polymorphic DNA），即随机扩增多态性 DNA（Williams 等 1990； Welsh 等 1990）。尽管RAPD 技术诞生的时间不长，但由于其独到的DNA 多态性以及快速、简便等特点，使它成为目前基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的重要手段之一。本文将对RAPD 技术的基本原理和特点、基本操作程序以及RAPD 技术在检测物种遗传多样性中的应用作一简单的介绍。 1.RAPD 技术的原理和特点 RAPD 技术建立在PCR 技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十聚体）为引物，对所研究的基因组DNA 进行PCR 扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB 染色或放射自显影来检测扩增产物DNA 片段的多态性，这些扩增DNA 片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA 多

RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA），意为随机扩增多态性DNA，是利用PCR技术进行随机扩增，把扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据DNA条带的多态性来反应模板DNA序列上的多态性。RAPD同AFLP、SSR等分子标记一样都基于PCR扩增，只是RAPD分析只需要一个引物，其引物长度一般为10个核甘酸，其序列是随机的，不同核甘酸序列的引物均有商品出售。 单引物扩增是通过一个引物在两条DNA互补链上的随机配对来完成。由于基因组DNA的差异，使引物与模板的结合位点及这些位点之间的距离不同，使PCR扩增后的片段大小表现出多态性。在基因组DNA分子内可能存在或长或短被间隔开的颠倒重复序列，如果这些序列与引物能碱基配对，则在两条单链上就会出现该引物的结合位点，结合位点的数量取决于这种重复序列的多少。不同DNA分子中这种颠倒重复序列间隔的长短不同，扩增条带的大小就不同，即表现出多态性。 10碱基引物理论上有410 种组合，不同引物检测的模板序列不同，用足够多的引物可覆盖基因组全序列，检测位点多，可以在完全不知道分子

倪宏波1 ,3 , 欧阳素贞2 , 王兴龙3 , 鲁会军3 , 雷连成3 (1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院, 黑龙江密山　158308 ; 2. 安阳大学畜牧兽医系, 河南安阳　455000 ; 3. 解放军军需大学动物科学系, 吉林长春　130062) 摘要: 通过优化反应条件和筛选随机引物,应用100 条随机引物对分离的20 株猪链球菌做随机扩增多态性DNA(RAPD) 分型研究。结果表明,有27 条引物呈现良好的多态性和稳定性,可产生稳定、复杂的指纹图谱。采用SPSS10. 0 软件分析了不同菌株之间的遗传距离,绘制出了菌株间的亲缘关系树状图,结果,20 株猪链球菌被分为4 个聚类群。 关键词: 猪链球菌; 随机扩增多态性DNA; 指纹图谱; 基因分型 　猪链球菌病是由链球菌感染引起的猪的一类疾病的总称。随着我国工厂化养猪业的不断发展,猪链球菌病已成为危害养猪业的一种重要疾病。该病一年四季均可发生,侵害不同年龄的猪,由于链球菌血清型多、抗原结构复杂,在临床上可呈现不同的特征,如败

黄璐琦 王敏 周长征_李念华*_何希荣 杨滨 （中国中医研究院中药研究所生药室，北京 100700；北京中医药大学中药学院 药用植物教研室，北京 100029；*中国科学院植物研究所，北京 100044） 摘要 以细辛类药材的鉴别为例，对RAPD方法在药材鉴别中所存在的问题探讨，结果表明药材DNA模板浓度，降解程度及药材的产地均对PAPD产物有不同程度的影响，从而提出选择适宜的药材DNA模板浓度，筛选合适的引物采用对照组聚类分析等方法来消除上述因素的影响，进而讨论了PAPD方法在药材鉴别上的适用范围。 关键词 多态性分析； 细辛类药材 90年代在polymerase chain reaction (PCR)技术基础上发展起来的随机扩增的DNA多态性分析(random amplofied polymorphic DNAs, 简称PAPD)已成功地应用于遗传多样性的检测、基因定位和品质鉴定等诸多领域，并已开始用于人参、西洋参、蛇类、地胆草等中药材的鉴定[1]。这一方法快速、简便且灵敏度高，但其应用于遗传多样性和系统学研究中所存在的问题，如DNA模板纯度、浓度及

黎裕 贾继增 王天宇 （中国农科院作物品种资源研究所，北京100081） 1 引言 1.1 分子标记概念的界定 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。 1.2 理想的分子标记的界定 理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。 但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。 2 分子标

其基本原理是：以PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、 实验材料 采用青稞叶片提取总DNA。 二、 实验设备 1.美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统， 2.美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机， 3.美国MJ公司PCR仪， 4.安玛西亚电泳仪等。 三、 实验 试剂 1. 试剂 ：请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。 DNA提取试剂盒； EcoRI酶,MseI酶，T4连接酶试剂盒；

【实验目的】 1．了解PCR-SSCP技术的原理。 2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。 【实验原理】 PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。 为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵

1．了解PCR-DGGE技术的原理。 2．了解并熟悉PCR-DGGE技术的步骤。 【实验原理】 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。 为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的G

O. Henegariu, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance and P.H. Vogt Indiana University, Indianapoils, IN, USA and Heidelberg University, Heidelberg, Germany 摘要： 多重 PCR 通过在同一个反应中同时完成多个基因的扩增成为临床与基础研究领域中一种简便快捷的筛选检测方法。已有大量文献详细的讨论了通常影响 PCR 反应质量的条件，而在多重 PCR 中常见的困难和重要的实验因素却鲜见报道。本文使用多对引物对多重 PCR 的各种条件进行了研究。研究表明，对于成功进行多重 PCR 尤为重要的因素是：用于扩增不同基因的不同引物对之间的相对浓度、 PCR 缓冲液的浓度、循环温度、氯化镁和 dNTP 浓度间的平衡。在实验的基础上，本文给出了一个多重 PCR 的标准方法，并给出常见问题的解决办法。 介绍： 多重 PCR 就是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增

用于荧光定量PCR仪的化学染料有多种，包括SYBR Green I、分子 Beacons、水解探针(TaqMan 探针)、ScorpionsTM 探针和AmplifluorTM系统。也可完成实时量化和DNA解链曲线。 SYBR Green I SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。 SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1。由解链曲线来分

一．原理 PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中，Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA片断选择性地吸附到silica膜上。经Buffer W1、Buffer W2洗涤去除残留在silica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到silica膜上的DNA片断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。 二．材料与方法 1 材料 PCR产物 2 仪器 、用具 恒温孵育器（65℃）、离心机、移液器、1.5ml 离心管 3 试剂 Buffer PCR-A；Buffer W1；已加无水乙醇的Buffer W2；Eluent或去离子水 4 方法 (1) 在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer

应用定量PCR技术，用一种标准作对照能够估计出一种特异性靶DNA或RNA分子的相对含量。 参照物： 在定量PCR 中必须加入参照物，用来作为扩增系统的阳性对照，并作为未知样本定量的标准，且通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率，使其具有可比性。参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。 内参照和外参照均是在定量PCR 过程中一种含量已知的标准品模板。根据参照物的不同，定量PCR分为竞争性定量PCR和非竞争性定量PCR。内参照是与待检样本加于同一反应管中，与样本共用或不共用同一对引物的标准模板。共用同一对引物者，两个模板的扩增存在竞争性，称竞争性内参照，这种条件下进行的定量PCR属竞争性定量PCR；相反，不共用同一对引物时则不存在竞争性，为非竞争性内参照，属非竞争性定量PCR。 外参照则是参照物与待检样本的扩增分别在不同的管间进行。采用外参照进行的定量PCR属非竞争性定量PCR。 非竞争性对照基因定量法： 即是靶基因与参照基因的同步扩增。是在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同

主题词　乙型肝炎病毒；DNA，病毒/分析；聚合酶链反应 中国图书资料分类号　R512.62 摘　要 目的　利用竞争PCR法建立分级测定HBV DNA含量的定量方法. 方法　设立3个标准竞争模板(10 2 cop, 10 4 cop, 10 6 cop)，分别和恒量的待测模板混合，分别进行40，30，20次循环的PCR扩增，最后凝胶电泳分离待测模板和竞争模板的PCR产物，测定两者的荧光强度的比值，计算待测模板的初始量. 结果　对乙型肝炎血清HBV DNA定量表明，12份HBeAg阳性血清，HBV DNA的血清浓度在6×10 7 ～1×10 11 cop/L，而12份HBeAb阳性血清只有7份可检出HBV DNA，它们的血清浓度均在3×10 8 cop/L以下，其余5份用该PCR方法，检测不到. 结论　该方法可用于HBV DNA以及其他病原体DNA的定量. Grading quantitative PCR

菌落 PCR（Colony PCR）可不必提取基因组 DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者 DNA 测序分析。最后的 PCR 产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。 具体方法：1、PCR 混合物的制备Taq buffer（10×） 20 uldNTP（2.5 mM） 5 ulPrimer Forward（50 mM） 10 ulPrimer Reverse（50 mM） 10 ulddH 2 O 147 ulTaq（2U/ul） 8 ultotal 200 ul将上述溶液混匀，10 ul 每管分装于 200 ul PCR 管中。 2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在 LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装 有PCR混合物的 PCR 管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是 1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。 3、将混有菌体的 PCR 混合物置于 PCR 仪中，按常规条件

蒋　敏1 , 贾文祥3 , 陈　岚1 , 周　伟1 , 李文胜1 , (1. 四川大学华西第二医院, 四川成都610041 ; 2. 四川大学华西医院, 四川成都610041 ; 3. 四川大学华西基础医学与法医学院, 四川成都610041) 摘要: 目的　建立一种多重PCR 方法,在同一扩增体系内同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因, 探讨采用多重PCR 同时检测淋菌及其耐药基因的可行性。方法　根据淋菌CPPB、TeM21、Tet2M基因序列,分别设计了3 对引物,并在同一扩增体系内行PCR 扩增,扩增的靶序列分别为150 bp 、224 bp 、316 bp 。结果　淋菌及其青霉素、四环素耐药的标准菌株,上述3 个基因位点的检测均为阳性,对125 例临床标本同时进行传统培养、药敏和多重PCR 检测,结果显示淋菌的检出率:培养法为20. 0 % ,PCR 法为24. 8 %;PPNG检出率:药敏法为16. 0 % ,PCR法为20. 8 ;TRNG检出率:药敏法为14. 4 % ,PCR 法为19

　PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 　　为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-S

　　一、PCR操作范例 　　在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg 2+ 和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA 试剂 盒提供的典型反应条件供参考。 表22-1 PCR反应混合液 成分 加入体积（μl） 最终浓度 双 蒸馏 水

　　PCR反应条件三要素为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间

凝胶纯化PCR扩增的靶序列 如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离: 1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离。 2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。 3.加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。 4.取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。 5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。 当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或 重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后 电