[ 仪器 、试剂、材料] （一） 仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。 （二）材料 总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜 （三） 试剂 NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。 [方法与步骤] 1. 用具的准备： 180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4

研究人员首次利用包装入病毒载体中的小分子RNA对有遗传疾病的小鼠进行治疗。这一成果提高了RNA干扰技术能够运用在人类临床试验上的可能性。 亨丁顿舞蹈症（Huntington’s disease）和脊髓性小脑萎缩症(SCA)均为遗传性疾病，其特征是患者神经退行性病变导致失调和痉挛。这两种疾病均由一种缺陷性蛋白引起。去除这种毒性蛋白是一个相当棘手的任务，现有的药物都不能解决。RNAi是一个新的候选技术，因为它能够直接破坏这种缺陷性蛋白的特定的信使RNA（mRNA）使之不能表达出蛋白。 为了证实这种方法的效果，爱荷华大学（University of Iowa）的Beverly Davidson及其同事构建了一种病毒，它能在侵染细胞后产生短的发夹结构的RNA，这些短RNA序列缺陷性ataxin-1（一种蛋白质，是SCA的病因）相对应。Davidson说，研究人员在亨丁顿舞蹈症的治疗研究中也做了同样的工作，但是这个ataxin-1的mRNA比较短且易操作。研究者将这种病毒注射进患有人类SCA病的小鼠的大脑中。通常这些小鼠小脑中的柏金氏细胞（Pur

Northern印迹的制备 预备： 1．按下述步骤，每泳道加10～20μg总RNA或0.5～1μg poly(A)+RNA进行甲醛/琼脂糖凝胶电泳，将凝胶放在紫外线透照仪上，旁边置一标尺进行拍照。 a. 总RNA（10～20μg）用下列溶液在65℃温育5min： 总RNA（10～20μg） 6.0μl 甲酰胺 12.5μl 10×MOPS缓冲液 2.5μl 甲醛溶液（37％） 4.0μl b. 置冰浴迅速冷却，加2.5μl上样缓冲液，并加样于按如下配制的甲醛/琼脂糖凝胶中。

【操作】 1．RNA的提取见前。 2．变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入 DEPC H2O 12.4ml，加热熔化，冷却至60℃时加入5×甲醛凝胶电泳缓冲溶液4.0 、37%甲醛3.6ml、混匀、制胶。待胶凝固后，置于1×甲醛凝胶电泳缓冲溶液中预电泳5min。 3．样品制备 取总RNA4.5 ，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲溶液4.0 、37%甲醛3.6 、甲酰胺10、于65℃温浴15分钟,水浴冷却。加入上样缓冲液2 。 4.电泳 上样（约15～40 ），50V电泳（电泳约2小时）， 直至染色剂跑到凝胶边缘为止。用已知相对分子质量的RNA作标准参照物,如用18s和28srRNA或者9s兔β珠蛋白的mRNA,这些RNA的长度分别为6333,2366和710个核苷酸。 5.电泳结束后,切下相对分子质量标准参照物的凝胶条, 浸入含溴乙啶的染色液中浸泡30～40分钟,紫外灯下照相,测量每个RNA条带到加样孔的距离。以RNA片段大小的Ig值对RNA条带的迁移距离作图,以此计算杂交相对分子质量的大小。 6．将变性RNA转移至硝酸

1.Total RNA isolation： 测定OD 260 ，OD 280 及两者比值，换算出RNA的浓度。并电泳鉴定。 2.Gel： 以80ml的1.5％甲醛琼脂糖凝胶为例： agrose：1.2g dd H 2 O：57.6ml 10×RNundefined(RNA buffer)：8ml（RNB具体配方见后，用表示，下同） 甲醛溶液：14.4ml 3. Electrophoresis： （1）加样：（以取20μg RNA为例）在0.5ml管中加20 μg RNA＋2－4倍RNA体积的SB溶液_，votex，65℃热变性10min，立即上冰5min，微离心一下，加相应的10×loading buffer（大连宝 生物 公司taq酶系列会提供），混匀，准备上样。 （2）预电泳：在正式上样电泳前，在胶点样孔中各加一点10×loading buffer（加的孔数要超过正式电泳所用的点样孔

1.概 述 mRNA差异显示技术（mRNA differetial display）是一种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。 方法建立：1992年 Liang P和Pardee首次应用DD技术对比人类乳腺癌细胞与正常细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因 目前已应用于个各领域： 农业、植物 动物 医学 • 胚胎发育 • 遗传病 • 药物 • 肿瘤 2.mRNA差异显示原理 是分离差异表达基因的一个重要方法。人类大约含有三万个不同的基因。在不同的单个细胞中只有10％的基因处于表达状态。 生物 体在不同的生理，病理状态下，基因的表达水平不同。 生命过程中选择性表达的基因主要有：发育与分化、体内平衡、对攻击的应答、细胞周期调节、老化和程序性细胞死亡等。 差异显示获得的只是某个基因的片段，而不是直接获得全长cDNA克隆。

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。 在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种 试剂 。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 一、 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被

1998年，Andrew Fire和Craig Mello提出了一项新技术：通过dsRNA诱导特异基因的沉默，即所谓RNAi。2000年，Amy Pasquinelli等将lin-4和let-7作小时序RNAs(stRNAs，mall temporal RNAs)。 RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。SiRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。SiRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。 由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonau

牛颜冰﹡，郭失迷，申林炎，雷万钧，雷霄飞 （山西农业大学，太谷 030801） 摘　要：RNA 沉默是真核 生物 的一种高度保守的和序列特异的RNA 降解系统，它不但是基础 生物 学领域的研究热点，同时在调节基因表达或研究基因功能方面也是非常有前景的。植物中的转录后基因沉默(PTGS)是RNA 沉默的一种形式，通过PTGS 能对目标RNA 进行特异性降解。对双链RNA(dsRNA)在RNA 沉默启动中所起中心作用的认知，形成了几种RNA 沉默载体的构建方法，这些方法与基因组资源相结合，通过转基因或非转基因的方法能够快速和高效研究植物的基因功能。 关键词：RNA 沉默；分析；基因功能 The research on the analysis of gene function in plants mediated by RNA silencing NIU Yan-Binundefined, GUO Shi-Mi, SHEN Lin-Yan, LEI Wan-Jun, LEI Xiao-

操作注意事项： 　　由于RNA酶的广泛存在与难以灭活的顽固特性。使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。为了保证RNA的研究工作成功，请仔细阅读下列注意事项，相信它能帮助您解决常见的问题。 归根究底，RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。RNA酶无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RNA酶污染，从而导致整个实验失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染是保证实验成功的关键，必须做到以下几点： 1.如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、 试剂 等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。 2.操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身，常常造成操作不便，而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。 3.尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。推荐使用出厂前已

1、RNase 是RNA制备的杀手 RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 2、塑料制品、玻璃和金属物品的处理 (a)塑料制品：尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理方法如下： (1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 (2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都

编者按：不同 生物 中RNA 结构和功能多样性与生命多样性的关系等问题是当前生命科学重大基础研究的前沿，特别随着基因组、蛋白质组计划相继提出后，RNA 组学研究已经成为分子 生物 学研究的新的生长点。本期RNA 专题由王恩多院士牵头，共组织了八篇与RNA 研究相关的高质量文章。在此，向王恩多院士及各位专家对本刊的大力支持表示衷心的感谢！ 张筱晨， 周 惠， 屈良鹄~0~0~0~0~0~0~0~0~A中山大学生物工程研究中心，广州510275) 摘　要：核仁小分子RNA(snoRNA)是一类广泛分布于真核生物细胞核仁的小分子非编码RNA，具有保守的结构元件，并以此划分为3 大类：box C/D snoRNA、box H/ACA snoRNA 和MRP RNA。其中box C/D 和box H/ACA 是已知snoRNA 的主要类型，以碱基配对的方式分别指导着核糖体RNA 的甲基化和假尿嘧啶化修饰。研究发现，snoRNA 除了在核糖体RNA 的生物合成中发挥作用之外，还能够指导snRNA、tRNA 和mRNA 的转录后修饰。此外

实验三 mRNA的分离纯化 【实验目的】 1．了解分离mRNA的原理 2．学习和掌握mRNA的分离、纯化方法和技术 【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10 -5 ?g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中 rRNA为75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。 真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A

广东农业科学 陈弟 多种RNA 提取方法的原理 Trizol法即异硫氰酸胍—苯酚法，异硫氰酸胍可以抑制RNA酶、防止RNA的降解，而酚的作用是使蛋白变性。其原理是内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。 热硼酸法 (Hot-borate，简称HB法)的原理是将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和LiC1选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物， 二硫苏糖 醇(DTT) 作为还原剂， NP-40 可阻止酚类物质氧化，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体，这些物质都可以抑制植物组织中酚类物质的氧化及其与RNA的结合，通过LiC1沉淀剩余的酚类物质，从而与RNA分开。 异硫氰酸胍法(Guanidine Thiocyanate，简称GT法)的提取液包括4 mol/L异硫氰酸胍、2

中国农业大学学报 刘洋 　　 CTAB是一种强变性剂，变性效果优于 SDS ，能够有效除去蛋白(含复合蛋白)等杂质。此外，与常规的CTAB法比较，本方法还有如下改进： 1) 在提取液中加入较高质量浓度的PVP。这不仅能有效地去除棉花组织中的酚类物质和多糖，还能去除一些其他色素物质和脂类，提高RNA的完整性和纯度。 2) 在提取液中加入β-巯基乙醇。棉花中含有大量的酚类物质，在细胞破碎时其自动氧化而与RNA不可逆地结合，从而影响RNA的产率和纯度，这也是棉花RNA难以提取的重要原因。在提取液中加入β-巯基乙醇，这不仅避免了酚类物质的氧化，还提高了RNA的产率和纯度。 3) 在用苯酚：氯仿抽提时，使用低pH的苯酚( pH 4.0 )。苯酚在低pH的情况下能促进水相中的蛋白和DNA向有机相分配，从而最大限度的除去总RNA中的蛋白和DNA。 4) 用LiCl选择性的沉淀RNA。这可以充分除去RNA中的DNA污染。如果必要，可以进行2次LiC1沉淀，但是，最后一步必须用70％(体积分数) 乙醇洗涤2次，避免RNA中因含有Li

包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。 RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mRNA仅占1%～5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。 RNA制备的条件与环境 为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。 从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸

TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR） 在分子 生物 学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列，TAIL-PCR又叫热不对称交错PCR，能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。 TAIL-PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经成为分子 生物 学研究中的一种实用技术。经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列，从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。 在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成： ①由特异性引物和简并引物扩增出的产物； ②由同一特异性引物扩增出的产物； ③由同一简并引物扩增出的产物。 在TAIL-

一、 定量PCR的基本原理： 在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。 1. 终点法定量原理： 在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中靶分子的准确含量，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理： 在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，若核酸

荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段，具有很高的灵敏度。但在早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原检测上，荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏度。放射性同位素标记技术的灵敏度虽然能达到1ng/ml，但在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防护，因此限制了它在实际过程中的广泛应用。1992年，Sano[1]等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-PCR（Immuno-PCR）。它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之处。 众所周知，PCR技自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术，也是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。而免疫-PCR技术正是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。 1 免疫-PCR的基本原理 免疫-PCR主要由两个部分组成。第一部分

( 1中国农业科学院作物品种资源研究所　农业部作物种质资源与 生物 技术重点开放实验室,北京100081 ; 2　河北农业大学农学院,保定071001) 摘　要: 　结合作者的工作实际,着重介绍了有效提高PCR 产物的几种方法:如怎样高效快速地设计PCR 引 物,怎样尽快确定PCR 反应的最适退火温度,如何提高GC 富集区的扩增效率等,为分子 生物 学工作者提供一些可 以借鉴的方法及经验。 关键词: 　 聚合酶 链式反应　PCR 引物　GC 富集区　梯度PCR Several Methodologies on Improving the PCR Products Li Aili1 , 2 　J iang Tao1 　Ma Zhiying2 　J ia J izeng1 ( 1 Key L aboratory of Crop Germplasm Resources and Biotechnology Mi nist