【原　理】 琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。 【操作步骤】 1、将凝胶成形模具两端用医用胶布封好，水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间。 2、称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧杯中，加入100ml 1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。 3、关闭电炉，取下三角烧瓶，将其置室温下冷却至70℃左右（手握烧瓶可以耐受），再加入溴化乙锭（10mg/ml）5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml。 4、室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，揭去二端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。 5、在电泳槽中加入1×TAE缓冲液，以高出

目前电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。 何谓电泳？在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象，称为电泳。 电泳时不同的带电粒子在同一电场中泳动速度不同。电泳速度常用泳动率（M）来表示。 泳动率也称迁移率。 它等于泳动速度（V）与电场强度（E）之比（1式），亦即带电粒子在单位电场强度下的泳动速度称泳动率。 在式（2）中，L为泳动距离，t 为通电时间；在式3中，V为加在支持物两端的端电压，d为支持物的有效长度。 将式2和式3代入式1得： 由式4可知，当d、L、V及t等数值为已知时（实验测得），可以计算求得泳动率M的值。 二、影响泳动率的因素 根据物理学原理，带电粒子在电场中所受电场力（F）等于电场强度与粒子所带电量的乘积 F=E Q （5） 在上式中，E为电场强度，Q为粒子所带电量。 又据Stokes定律，一个球形分子在溶液中泳动时，受到的阻力（F／）与球形分子的半径（r）、溶液

电泳技术发展史 1809年俄国物理学家Рейсе 首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis 首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH 的溶液在U 形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937年瑞典Uppsala 大学的Tiselius 对电泳 仪器 作了改进，创造了Tiselius 电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ 球蛋白组成的，由于Tiselius 在电泳技术方面做出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年Wieland 和Fischer 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点： ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N"甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有 格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。 ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成 不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子 的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物 质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。 ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。

电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。 电泳技术的基本原理和分类 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从 Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时： F＝F′即 QE＝6πrην 可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。 电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。前者包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常

一：电泳（Electrophoresis）：带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极移动的现象。 电泳分析技术：利用电泳现象进行物质分离的技术。 二：影响电泳的因素： 1． 带电粒子的带电状态（电量和电性）。 2． 带电粒子的分子量大小和分子形状。 3． 电场强度。 4． 缓冲液的PH 值，组成成分及离子强度。 5． 支持介质的吸附和电渗作用。 三：蛋白质电泳的机理 1． 蛋白质是两性电解质： 当 PH=PI 时，所带净电荷为零；当 PH>PI 时，所带净电荷为负；当 PH 距离PI 越远时，所带电量越多。 2． 不同蛋白质等电点不同，在同一缓冲液中所带电性及电量不同，电泳时迁移的方向和速率不同。 3． 不同蛋白质分子量大小和分子形状不同，故迁移率不同。 四：实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 （一） 原理： 1． 人血清蛋白质的分类，等电点，分

::::DNA芯片:::: 最近, 在后基因组时代纷繁的信息中, 生物芯片 看起来成了最重要的研究工具之一. 生物芯片与电子工程学中的硅半导体芯片非常相似. 高密度小尺寸的DNA和蛋白质芯片被用来筛选生物信息, 以便于更快更好的研究. 纳米基因芯片 DNA芯片是现代芯片技术中最成功的案例. DNA技术使用了DNA双螺旋链中A-T和G-C这样的Watson-Crick对的的典型的性质以及对互补序列识别的性质. 换句话说, DNA芯片上的单链被当作诱饵, 而当 加入DNA试样时候, 只有其互补链与之成键. DNA芯片能包含数千到数十万种DNA诱饵, 这样就可以筛选任意数量的DNA样品. 因此审查的速度是令人惊异的. 因为在一枚芯片上的DNA诱饵的序列都已知, 重要的是找出要筛选的DNA与哪一位置结合. 为检测诱饵-样品DNA成键的数量, 通常样品DNA被涂以萤光染料然后扫描机读取芯片上的荧光强度. 强荧光度意味着样品中有许多互补DNA链与诱饵DNA链

生物 识别技术和 生物 识别系统 生物识别技术（Biometric Identification Technology）是利用人体生物特征进行身份认证的一种技术。生物特征是唯一的（与他人不同），可以测量或可自动识别和验证的生理特性或行为方式，分为生理特征和行为特征。 生物识别系统对生物特征进行取样，提取其唯一的特征并且转化成数字代码，并进一步将这些代码组成特征模板，人们同识别系统交互进行身份认证时，识别系统获取其特征并与数据可中的特征模板进行比对，以确定是否匹配，从而决定接受或拒绝该人。 生物识别技术的发展 人类利用生物特征识别的历史可追溯到古代埃及人通过测量人体各部位的尺寸来进行身份鉴别，现代生物识别技术始于70年代中期，由于早期的识别设备比较昂贵，因而仅限于安全级别要求较高的原子能实验、生产基地等。现在由于微处理器及各种电子元器件成本不断下降，精度逐渐提高，生物识别系统逐渐应用于商业上的授权控制如门禁、企业考勤管理系统安全认证等领域。 用于生物识别的生物特征有手形、

一、 细胞悬液的制备 ： 1. 吸弃旧培养基，D-Hanks冲洗2遍 2. 0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入 离心管 ，1000rpm，离心10min，弃上清，以1mlD-Hanks悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞2~3×10 6 个，必须分散成单个。悬浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。 二、玻片制备 ： 1. 玻片磨砂。 2. 制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4 PBS配制。称0.1g溶于20mlPBS，如NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.65%。 铺第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温>5min使其固化，即为第一层胶； 第二层胶：37℃ 0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2×10 6 ）细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上

【实验目的】 掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。 【实验原理】 在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。 【 仪器 、材料与 试剂 】 1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L ED

【原理】 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis，CIEP）是指在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗体在琼脂凝胶中，由于电泳和电渗作用抗原，抗原向正极移动，抗体向负极移动。将抗原放负极端，抗体放正极端，则抗原抗体相向移动，在两孔之间相遇，在比例合适时形成沉淀线。以Sm和RNP（核糖核蛋白）等可提取性抗原（extractable nucleat antigen，ENA）检测相应抗Sm和RNP为例。 【材料】 1． Sm/RNP抗原制备 将新鲜或冻存于-30℃的小牛胸腺除去脂肪与结缔组织后，用0.004 mol/L 氯化钙-0.28 mol/L蔗糖溶液洗净，切碎。每50 g胸腺加上述含钙0.28 mol/L蔗糖450 ml。于匀浆器中慢档（约8000 r/min）匀浆2～3 min（速度过高，核可能破坏）。两层纱布过滤，滤液1500 r/min离心20 min，弃上清液（胞浆成分）。沉淀（核）用0.004 mol/L氯化钙-0.25 mol/L蔗糖洗1次。用50 ml pH 7.1 0.1 mol/L PBS（

这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳， 因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。 1）在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体： 6mol/L乙二醛 5.4μl DMSO 16.0μl 0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl RNA（多达10μl） 5.4μl市售乙二醛通常为40％溶液（6mol/L）。 由于接触空气的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 501-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液pH值大于5.0为止，然后可分装在小份， 用盖紧的小管贮存于－20℃。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液体应予丢弃。0.1mol/L磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将3.9ml

Native-PAGE原理 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下， 对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。 实验方法 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。 一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性

[实验原理] 制备电泳与普通的分析电泳在原理上没有什么不同，只是用的凝胶厚些、加的样品量大些罢了。因为制备电泳的胶厚，电泳时有个散热问题，电泳后还有把所要分离的蛋白从胶中洗脱下来的问题。为了提高制备电泳的效率，有些公司（如BIO-RAD）生产了专为制备电泳设计的电泳槽。我们的实验用非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳制备GFP，在整个的电泳过程中GFP始终维持其天然活性。电泳结束后，不用染色处理，在紫光照射下可以很容易地将发绿色荧光的GFP条带从凝胶上切下来。 [实验操作] 1、用1.5毫米夹条的玻璃板做胶，分离胶的浓度仍为12%，注意用不含SDS的非变性系统缓冲液配胶，配浓缩胶时也同样。 2、做浓缩胶时不加梳子，而是做分离胶那样用水封顶，使浓缩胶的顶部形成一平面。 3、制备电泳的蛋白样品与前次免疫印迹的相同，用非变性的样品缓冲液做样，样品不加热处理。上样前要充分离心(1.5mL 离心管 ，12000rpm，5分钟），勿

一、实验目的： 1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理； 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理: 1、电泳： (1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 (2)影响电泳效果的因素： ①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； ②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； ③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； ④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； ⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） (1)定义

一、蛋白质SDS-PAGE电泳 1、安装垂直板电泳装置 用洗洁精、清水和无水乙醇清洗两块玻璃板，晾干后安装。 2、制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶 （1）配制9%分离胶（15ml）：双蒸水6.55ml，1.5M Tris-HCl（pH8.8）3.75ml，30%丙烯酰胺储存液（Acry/Bis）4.5ml，10%SDS 150ml，10%过硫酸铵（APS）50ml，混匀后加入3.75ml TEMED，立即混匀，灌入装好的垂直板中，至距离短玻璃顶端约2cm处。检查是否有气泡，如果有，用滤纸条吸出。在胶液上面加一层双蒸水，静置，待凝胶与水的界面清晰时，说明分离胶已聚合（约30分钟），去除水相，用滤纸吸干残存的液体。 （2）配制4%浓缩胶（10ml）：双蒸水6.1ml，0.5M Tris-HCl（pH6.8）2.5ml，30%丙烯酰胺储存液（Acry/Bis）1.3ml，10%SDS 100ml，10%过硫酸铵（APS）50ml，混匀后加入10ml TEMED，立即混

一、原理 用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，使样品的蛋白质分子的迁移率完全取决于分子量。如在电泳体系中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate简称SDS）。这种阴离子表面活性剂浓度大于1mmol/L时，以1．4gSDS与1g蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了各种蛋白质天然电荷差别。巯基乙醇是蛋白质分子中二硫键的还原剂，使多肽组分分成单个亚单位。SDS可打断蛋白质的氢键。因此它与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变，此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似长椭园的棒状。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1．8nm，而长轴改变与蛋白质的分子量成正比。所以，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是按照分子的大小由凝胶的分子筛效应进行分离，其有效

【实验目的】 了解和掌握双向电泳技术，并学习用它来研究与DNA 复制相关的问题。 【实验原理】 DNA 分子有线状的，还有一些非线状的，如复制叉和重组DNA 结构。双向琼脂糖凝胶电泳技术就是被人们开发用以研究一些非线状DNA 分子的。双向琼脂糖凝胶电泳技术(2-D gel)实际上可分为两类：中性/中性双向凝胶电泳和中性/碱性双向凝胶电泳技术。它们的工作原理如下： 中性/中性双向凝胶电泳：非线状的DNA 分子在琼脂糖凝胶中的泳动行为和线状DNA 分子相比是不规则的。并且这种行为随着琼脂糖浓度或电压增加而加剧。而这正是中性/中性双向凝胶电泳的工作原理：在第一向中，样品在琼脂糖凝胶中以低琼脂糖浓度、低电压的条件进行电泳，则DNA 分子主要根据其分子量大小被分离。在第二向中，则采用高浓度琼脂糖凝胶和较高电压条件，DNA 分子的分离则主要根据其形状。 中性/碱性双向凝胶电泳：此方法适合用来分析DNA 复制中间体。这些中间体包括各种长度的新链部分。在第一向中与中性/中性双向凝胶电泳一样采用中性pH，将DNA

【 实验目的 】 1.进一步掌握电泳的基本原理及凝胶电泳的原理。 2.熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。 3.掌握正常人血浆脂蛋白的分类。 【 实验原理 】 琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3，6脱水L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%～99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。 血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在。各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。 图 10-1

【实验目的】 1. 熟悉定量的基本操作，练习使用定量的计量 仪器 。 2. 掌握分光光度计的使用。 3. 掌握比色法原理。 4. 掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理和方法。 【实验原理】 （一）比色分析法 比色分析法是通过比较有色物质溶液颜色的深浅，来测定该物质浓度的方法。有些被检测的物质溶液本身就具有颜色，而有些物质虽不具有颜色，但可于试样中加入某种适宜的试剂，使其产生有色化合物。溶液颜色的深浅与