荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, 简称FISH)由于其直观, 快速, 敏感性高和方便灵活越来越得到广泛应用, 尤其是在血液学领域中. 因为白血病标本比较容易取得和制备, 不同类型的白血病又往往有其特异的染色体异常, FISH在白血病诊断, 治疗监测, 预后估计和微小残留病检测等诸方面都正成为不可缺少的重要手段. 　　FIHS技术本身也在新的需求下不断更新和完善.FISH的基本原理很简单, 就是标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退火杂交, 通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况. 　　FISH探针按标记方法可分为直接标记和间接标记: 用 生物 素(biotin)或地高辛(digoxingenin)标记称为间接标记, 杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号, 因而 步骤较多, 操作麻烦, 其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大; 直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记. 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号,

一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1．取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol／LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ／tube)，-80℃保存。 2．转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng／μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3．轻轻摇匀，冰浴30min。 4．42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。 5．加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转／min水浴孵育60min。 6．取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的LB-氨苄青霉素50mg／ml,1μl／ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。

染色体步移技术（genome walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用： ①根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究； ②步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列； ③鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等； ④用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列； ⑤用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。 对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。 以PCR技术为基础的染色体步移的

实验原理 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，

带有标记的（有放射性同位素，如 3 H、 35 S、 32 P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质)DAN或RNA片段作为核酸探针，由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示（visual－ization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。 a) 固定 原位杂交组织化学技术（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类

杂交实验所选择的核酸探针可以分为两种：克隆的或合成的。实验中，应根据不同的杂交实验选择相应的核酸探针。一般来说，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。特别是当存在特异的克隆，或当DNA序列未知而又必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，常常选用克隆探针。 RNA探针也是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶核酸序列的杂交反应效率极高。克隆探针一般比寡核苷酸探针的特异性强，复杂性也高，并可获得强的杂交信号。合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点： ①由于链短，其序列复杂度低，相对分子质量小，所以，和等量靶位完全杂交的时间较克隆探针短； ②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因此短探针中碱基的错配能大大降低杂交体的Tm值； ③可大量合成，价格廉价。 在分子杂交技术的发展早期，较多使用放射性同位素如32P、35S等来标记核酸探针，在相当一段时间内，放射性同位素被视为探针的传统标记物且发挥着重要作用，它有十分明显的优点如灵敏度高、特异性高以及方法成熟简便。但随着分子杂交技术的发展，它的缺

【实验目的】 （1）了解实验的常规仪器、设备、耗材。 （2）掌握本实验所用仪器的功能和使用方法。 【实验内容】 一、验室的常规仪器、设备 (一) 温度控制系统： 1. 冰箱: 根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰箱，最常使用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。 4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。 -20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。 -80℃适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。 0-10℃的冷柜适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。 2．液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速冻和长期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196℃）具有经济、省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。 3．培养箱：37℃恒温箱用于细菌的固体培养和 细胞培养 。

一、 建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 二、 选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt En

原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。 一、探针的制备原则和选择 探针为RNA或双链、单链DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组DNA杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。 探针的获得常采用随机引物延伸法的P

1.配制溶液时，必须随时搅拌或振荡混合。配制完了时，必须充分搅拌或振荡混合。 2.搅拌使用的玻璃搅棒，必须两头都烧圆滑。 3.搅棒的粗细长短，必须与容器的大小和所配制的溶液的多少呈适当比例关系。不能用长而粗的搅棒去搅拌小离心管中的少量溶液。 4.搅拌时，尽量使搅棒沿着器壁运动，不搅入空气，不使溶液飞溅。 5.倾入液体时，必须沿器壁慢慢倾人以免有大量空气混入。倾倒表面张力低的液体(如蛋白质溶液）时，更需缓慢仔细。 6.振荡溶液时，应沿着圆圈转动容器，不应上下振荡。 7.振荡混合小离心管中液体时，可将离心管握在手中，以手腕、肘或肩作轴来旋转离心管; 也可由一手持离心管上端用另一手弹动离心管；也可用一手大拇指和食指持管的上端，用其余三个手指弹动离心管。手指持管的松紧要随着振动的幅度变化。还可以把双手掌心相对合拢，住离心管，来回挫动。 8.在容量瓶中，混合液体时，应倒持容量瓶摇动，用食指或手心顶住瓶塞，并不时翻转容量瓶。 9.在分液漏斗中振荡液体时，应用一手在适当斜

实验目的：淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。水稻萌发时淀粉酶活性最强。水稻萌发时淀粉活性的大小与种子萌发力有关。过氧化氢酶也普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系。本实验通过对水稻萌发期淀粉酶活性测定以及对幼苗期过氧化氢酶活性的测定，学习和掌握淀粉酶和过氧化氢酶的测定方法，了解水稻生长与之代谢的关系。 Ⅰ 淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。 植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。 二、实验材料、 仪器

从细胞 生物 学可知，真核细胞的出现，是生命发展质的飞跃。生命特征在于生命的延续性；细胞自我复制（细胞分裂）和细胞分化是生命延续的保证。细胞结构和 生物 性状代代相传即遗传性，遗传的变异和新性状的出现是生命的进化。生物遗传性曾长期被认为是神秘和不可测知的生命现象。孟德尔1865 年发现了遗传因子（基因），虽然赋予遗传性以物质实体性的概念，但却长久未能获得令人信服和可以感知的证据。直到20 世纪50 年代，Crick 和Watson 阐明DNA 双螺旋结构和它的半保留复制机制后，遗传的秘密才大白于天下，从而DNA也就成了人们研究遗传性和基因确切无误的对象，进而导致分子生物学技术的形成，并以一泄千里之势，不断向前发展。 当前分子细胞学内容已极其丰富和复杂，难以尽述，也非本书目的，本节仅就与后述技术相关问题作扼要回顾，更深入的内容，请读者参阅其它资料。 一、细胞和基因 （一）细胞的基本生命活动 细胞自我复制和细胞分化是细胞生存中的主要生命活动。细胞分化是细胞结构和功能的特化；是

超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(O 2 - )是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O 2 - )而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。 按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×10 4 ，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-

摘要： SOD的催化使超氧自由基(O 2 - )被破坏，并针对氧毒性筑起了第一道防线。SOD的活性及其检测技术与许多不同领域都息息相关，如医药、生化、植物生理、食品工程等。在过去的几十年中，人们已经发现了各种各样的SOD检测方法，但是，这些方法在选择性、检测速度、价格、简便程度上都存在各自的缺陷。最近，我们发现水溶性四唑盐如XTT，WST-1，WST-8适合用于O 2 - 的检测并且也可以被用于SOD的检测。在这些四唑盐中，WST-1灵敏度高，氧化态的吸光度低，水溶性好，因此，最适合用来做SOD检测。这种用WST-1来检测SOD的方法可以被用于鼠红血球、心脏、肝脏等生化样品中。我们还发现了一种使用了WST-1的流式注射法检测SOD的检测系统，通过这个系统能够进行快速的检测（每小时可以检测30个样品）。 常用的几种SOD检测方法： 1.分光光度法 分光光度法是最为典型的检测SOD的方法，这种方法使用了细胞色素 C(cytochrome C)或者氮蓝四唑（NBT）（图1

一：玻璃 仪器 的洗涤及干燥： （一） 意义：去除干扰物，提高实验结果的准确性。 （二） 常用洗涤剂： 1． 洗衣粉，肥皂，洗洁精，去污粉----用于一般去污。 2． 强酸，强碱，尿素------去除蛋白质，核酸。 3． 铬酸洗液------见附2。 4． 水（自来水，蒸馏水）------用来冲洗容器。 （三） 洗涤方法： _洗涤程序：泡→洗（→泡）→冲→漱 1． 新 仪器 的洗涤： 2%的盐酸浸泡数小时→自来水冲净→洗涤剂溶液中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10 遍→蒸馏水漱洗 内壁3 遍→包装、消毒→干燥备用。 2． 非定量敞口仪器的洗涤（试管、烧杯等）用后立即放入洗涤剂溶液或清水中浸泡过夜→试管刷蘸肥皂、洗衣粉或去污粉擦洗容器内外壁→自来水冲10 遍→检查是否洗净→蒸馏水漱洗内壁3 遍→包装、消毒→干燥备用。 注意：检查毛

一、实验目的 掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。 二、实验原理 1.血糖指的是血液中哪一种糖？ 葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。 2.用什么方法测定？ 测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。 3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗？ 不行，可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。 三、材料、 仪器 与试剂 （一）、材料：动物血液 （二）、 仪器 （仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿 （三）、药品（ 试剂 的选择

吕卓远 常莹 李蒙萌 安健博 北京大学医学部 基础医学院 医学实验04级 摘要 我们知道生物大分子，如蛋白质、核酸的特殊空间构象的形成绝大多数是可逆的热力学反应，因此对此过程的热力学研究有着很大的意义。这个过程需要利用目标分子直接测量伴随生物大分子反应的热效应。实现这一程序需要具有很高灵敏度的量热技术，即差示扫描量热技术（DSC）和等温滴定量热技术（ITC），得以测量在固定溶液环境下，随温度变化放出的热量。或测量在固定温度下，随溶液环境变化放出的热量。在本篇综述中，我们主要介绍DSC和ITC的主要原理，以及它们在生物医学领域中的应用。 关键词 微量量热技术 差示扫描量热技术 等温滴定量热技术 生物大分子 正文 1．前言 在升温和降温的过程中，物质的结构和化学性质会发生变化，其质量、几何尺寸、光、电、磁、热、力等物理性质也会发生相应的变化。微量量热技术被定义为在温度程序控制的条件下测量物质的物理性质和温度关系的一类技术。 微量量热技术是近年来发展起来的一种研究生

一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C 1 酶、C X 酶和¦Â-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C X 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，¦Â-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要 仪器 和试剂 1．实验材料 （1）纤维素酶制剂 500mg （2）新华定量滤纸 50mg / 份 × 4 （3）脱脂棉花 50mg / 份 ×

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。 其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。

介 绍 抗体和抗体产品在很多商业化产品中扮演了重要角色，如生物医药、诊断 试剂 盒以及色谱介质等。这些产品的质量控制对生物医药企业以及诊断 试剂 公司来说是至关重要的。通常用于检测抗体产品质量的方法有电泳和色谱法，它们能提供结构信息但不能提供结合活性的信息。例如无法给出不同批次间抗体产品活力的差别。等温滴定微量热技术(ITC)提供了一种非常简单而且准确的方法用于抗体的质量控制以及抗体和抗体产品的性质分析。ITC可以快速有效地测定多种参数，例如抗体亲和力(Ka)、抗原结合热(ΔH)以及抗原抗体的结合比（n）。抗体结构上的改变(例如片段化、部分变性以及偶联修饰)都会影响抗体的结合性能。另外，结合热可以用来指示抗原抗体在体内和体外的相互作用。 图1 典型的ITC抗体实验结果图 上半部分表示每次注射采集的数据。下半部分表示每次注射的释放的热量（上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图 在ITC实验中，一个配体（如受体、抗体）分子在恒温条件下滴定到另一