该方法是利用荧光素经单一波长（蓝光）的偏振光照射后，能吸收光能并发射出相应的偏振荧光，其强弱程度与荧光分子的大小呈正相关。 荧光偏振免疫分析常用于测定半抗原的药物浓度。反应系统内除待测药物外，同时加入一定量用荧光素标记的相应药物（小分子），使二者与有限量的特异性 抗体 （大分子）竞争结合。当待测药物浓度高时，经过竞争反应，大部分 抗体 被其结合，而荧光素标记的药物多呈游离的小分子状态。由于其分子小，在液相中转动速度较快，测量到的荧光偏振程度也较低。反之，如果药物浓度低时，大部分荧光素标记药物与抗体结合，形成大分子的抗原抗体复合物，此时检测到的荧光偏振程度也较高。根据荧光偏振程度与药物浓度呈反比关系，我们可以建立座标系。通过检测反应系中偏振光的大小，从坐标曲线上就可以精确地得知样品中待测药物的相应含量。

一、概述 颗粒性抗原（细菌、螺旋体、红细胞等）与相应的抗体血清混合后，在电解质参与下，经过一定时间，抗原抗体凝聚成肉眼可见的凝集块，这种现象称为凝集反应。血清中的抗体称为凝集素（Agglutinin），抗原称为凝集原（Agglutinogen）。 细菌或其他凝集原都带有相同的电荷（阴电荷），在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。抗原与抗体相遇后，由于抗原和抗体分子表面存在着相互对应的化学基团，因而发生特异性结合，成为抗原抗体复合物。由于抗原与抗体结合，降低了抗原分子间的静电排斥力，抗原表面的亲水基团减少，由亲水状态变为疏水状态，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒。出现了肉眼可见的凝集反应。 一般细菌凝集均为菌体凝集（O凝集），抗原凝集呈颗粒状。有鞭毛的细菌如果在制备抗原时鞭毛未被破坏（鞭毛抗原在56℃时即被破坏），则反应出现鞭毛凝集（H凝集），鞭毛凝集时呈絮状凝块。

（一）原理 可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒（称为载体）表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。 载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。间接凝集反应的优点为：①敏感性强：间接凝集反应是最敏感性的血清学反应方法之一，可以检测到微量的抗体和抗原；②快速： 一般1h～2h即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟；③特异性强；④使用方便、简单。 （二）载体 具有吸附抗原（或抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。 良好载体有如下几点基本要求：①在生理盐水或缓冲液无自凝倾向；②大小均匀；③比重与介质相似，短时间内不能沉淀；④无化学或血清学活性；⑤吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。 目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。而后者应用更广，因为其来源方便。另外绵羊红血球的表面有大量的（约1 000个

1．材料 (1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。 (2)1640培养液 (3)2.5％FCS－1640营养液 2．操作方法 (1) 拉颈或用CO 2 处死小白鼠。 (2将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。 (3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。 (4)用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。 (5)直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。 (6)以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。 (7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。 (8)重复⑹、⑺步骤。 (9)计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。 （二）骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细

经文学事业上的资助者的CTL活性测定方法为51铬（Cr）释放法，本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验；④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素测定法。 1 荧光测定法 1.1 测定法 1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法[1] alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。具体测定方法是：在靶细胞孔（T）、效应细胞孔（E）和实验孔（T+E）各加alamarBlue,共育6~24h后用板式荧光测定仪测530nm（发射）/590nm（散射）波长荧光强度，将T及E孔荧光均值相加后减去实

1．标记酶的选择条件 ⑴ 活性高，分解底物的能力强。 ⑵ 特异性强，即作用于底物的专一性强。 ⑶ 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。 ⑷ 与底物作用可以显色。 ⑸ 纯度高、易纯化，即含杂蛋白少。 ⑹ 可溶性(水溶性)好，在溶液中稳定。 ⑺ 测定方法简单。 ⑻ 酶来源方便、价格低廉。 2．符合条件的酶 ⑴ 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。 ⑵ 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。 ⑶ β-半乳糖甙酶（β-galactosidase），分子量540 000。 ⑷ 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 000。 其中以HRP最为常用，因其具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。 3．辣根过氧化物酶 HRP广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白，含糖量18%，它由300个氨基酸和4个二硫键连接而成。分子量40 000，等电点5

组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。 在免疫组化染色后的镜下观察中，有发现这样的结果，阳性物反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性，这是因为： 1.组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封闭抗原的决定族。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键8。这也是甲醛的一个作用，因为它是一种聚合固定剂，因而能在相邻的蛋白质键间形成桥键的作用。 2. 甲醛在保存进程中会形成羟甲基，也可封闭抗原决定族。据French和Edsall的研究认为，最常遇到的甲醇反应，就是加到一个含反应性氢原子的化合物中，形成一个羟甲基化合物。 3.在组织固定过程中，甲醛与蛋白质发生交联，形成醛交联蛋白，这种化合物封闭了抗原，使之无法表达出来。 为了解决上述存在的问题，更好地暴露

交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD 235 nm/OD 280 nm＜3时，即为好的交联剂。 戊二醛交联法又分为一步法和二步法。 ⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG－AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液 4℃ 充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊

乳腺Ca是女性中最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有120万妇女发生乳腺Ca,并有50万左右的患者死于这种病。由于这种病严重地危及了妇女的健康，世界上许多有关的机构都开展了对该病的研究，直至现在，根据对该病的治疗和有关文献资料显示，该病在治疗和预后方面已经取得了重大的进展。 当患者被诊断为乳腺癌后，根据目前临床上治疗的需要，提出了重点必须检测的主要免疫组织化学的指标即：Her-2、ER、PR、EGFR、IGBR、P53、CD117、BCL-2、PCNA等。 (1)乳腺的正常结构 乳腺的来源起于胚胎外胚层的原始表皮，位于胸前两侧皮下浅筋 膜的浅层与深层之间。肉眼大体为乳头，乳晕和乳腺。从临床的角度常将乳腺分为五个不同的区域，即乳晕区外上象限区，内上象区，外下象限区和内上象限区。其中外上象限区的乳腺组织最为丰富，但也是肿瘤的好发区。一发现该部位有硬块或者异样，就必须及早做检查。 从组织学的角度，乳腺被结缔组织分隔为15-25叶，每叶又分为若干小叶，每个小叶有肌上皮细胞。由单层柱状上皮，复层柱状上皮和复层扁

免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十分重要的位置。 （一）细胞标本的取材 目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。CEA应用于胸腹水中间皮瘤与癌的鉴别。McAb应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、表面抗原特点以及肿瘤结构成分改变等方面的研究均起到了积极作用。 细胞标本的取材有以下3种方法: 1．印片法　　主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便粘附在玻片上，立即浸入细胞固定液内5-10min，取出后自然干燥，低温保存备用。 优点是简便省时，细

在临床活检工作中，对于各种肿瘤的正确判断，历来是外科病理学的核心问题。因它关系到患者的治疗和预后的问题。在免疫组化技术没开展以前，主要靠HE，特殊染色和组织化学来进行鉴别和诊断各种肿瘤，这些在当时虽然解决了不少的问题，但是对于较为复杂，较为多型性的肿瘤，就不能对其起源及所含的成分作出正确的判断。随着免疫组化工作的开展，给许多以往有待于解释原因的病理诊断上带来了福音。许多以往无法解释原因的病例，经现今免疫组化染色技术的处理后，能够对其起源，相关的抗原或抗体成份给予显示出来，为肿瘤的诊断提断了形态学的依据。虽然如此，对于一些较为复杂的抗原，就要根据具体情况作具体分析。在生物界里面某些细胞仅具有一个抗原的决定簇，这是极少见的，而常见的是具有数百个乃至数千个的抗原决定簇。数量之多但又不是千篇一律，并非都在细胞的表面表达出来，加上细胞的排列有高有矮，有长有短，切片时有的被切到细胞膜，有的被拦腰斩断，因此在一张切片上看到的同一种抗原的表达也不一致，有的在细胞核，有的在细胞膜，也有的在细胞浆，这种现象是由于切片的原因所致。但是，抗原的表达，在原来的表达上就有核、浆、膜之分。有的抗原可在

在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量（图3-1）。 图3-1　紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 　　用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。 　　免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。 　　一、直接法 　　1．检查抗原法 这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差（图3-2）。 图3-2 直接法

免疫酶细胞化学是免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）中最常用的方法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原/抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术：即预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。 40多年前，Coons及其同事利用荧光色素（FITC）标记抗体而开创的免疫荧光抗体技术，具有一定的灵敏性、特异性、操作简单等优点，但亦存在抗体用量大，标本不能长期保存、需较昂贵的荧光显微镜等问题。几乎在同一时期，电子显微镜在医学生物学领域中得到了广泛的应用。为克服荧光抗体法的不足、并能在超微结构水平定位抗原物质的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替荧光色素标记抗体，进行组织细胞内抗原或半抗原的定位，开辟了酶标抗体技术免疫酶细胞化学之路。 　　Sternberger（1970）等人在此基础上又作了改良，建立了非标记抗体酶法以及PAP法。酶标抗体法确立至今已经27个春秋，不断发展、成熟。各种新技术的引入，使新抗

（一）\什么叫免疫组织化学？ 简单地说，用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位。目前免疫组织化学作为病理诊断，鉴别特殊病例，是不可缺少的最重要的手段，国内在免疫组织化学的应用方面已经普遍地展开并扩展至基层单位，为病理事业做出应有的贡献。 抗原（抗原，AG） 它是一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与 免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。 1）抗原的性质 ① 异物性。它是抗原所具有的特性，机体对进入体内的某些异物，异体大分子物质可产生免疫应答。目前生物制剂公司利用这一原理生产出许多适合于临床诊断的抗体。但是，并非所有的异物都是抗原。例如矽尘等一些生物性高分子聚合物，它们不会刺激机体的免疫系统产生相应的抗体物质，而只是肺对吸入的矿物性和有机粉尘的非肿瘤性反应[1]。矽肺是肺吸入矽颗粒沉积的结果，也是机体对另一种外来物反应的结果。 ② 理化性状。凡

一、固定 若想得到理想的ICC染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性（Immobility）和免疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的，所以说固定是ICC染色中非常重要的一环。ICC与其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外，还需保存组织抗原的免疫活性。一般认为，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性，但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。Cumming（1980）报告，不固定的组织切片ICC染色时，环鸟苷酸含量丢失80%以上。固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的关键一步。用于ICC的固定剂种类较多，选择时应根据所要检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。制片及固定方法见第一章　，下面介绍两种近年报道的新方法。 1．AMEX（Acetone Meth

1941年，浣熊等建立了免疫荧光细胞化学技术，它的原理是根据抗原抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。应用的方法有直接法、间接法、夹心法和补体法等。在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。目前，免疫荧光细胞化学技术已经广泛地应用于许多研究领域，如免疫学、微生物学、病理学和临床检验学等。 由于免疫荧光细胞化学技术所具有的特异性、快速性和某方面的准确性，又由于许多新技术和仪器的应用如激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜、荧光激活细胞分类器等，该项技术可发展至更高的阶段，开创更新的领域。虽然如此，应用于临床作为病理学的诊断还是少之又少，相信随着各种技术的提高，在不久的将来，将会有更多的荧光抗体被应用于临床的诊断。 （1）常用的抗体和蛋白质标记的荧光素有： ①异硫氰酸荧光黄（Fluoresein isothiocyanate，FITC）：结晶粉末状，呈黄色、橙黄色或褐黄色，易溶于水和酒精等溶剂，室温下可保

一、本科标抗体法 　　酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。 　　（一）酶的种类及特点 　　从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1，供选用时参考。 表4-1 免疫细胞化学常用的酶 名 称 分 子 量 内 源 性 商 品 Horseeradish peroxidase(E.C.1,11,1,7) 40～45KD + 有 Alkaline phosphatase (E.C.3,1,3,1) 80～120Kd ++ 有 Acid phosphatase (E.C.3,1,

　　大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 　　目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 　　1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 　　试剂：多聚甲醛　　　　　　　　　　40g 　　0.1mol/L磷酸缓冲液　　　　　　　　至1000ml 　　配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n

一、确定神经递质的性质、定性和分布 早期的神经科学工作者应用传统的神经解剖学研究方法如甲基蓝染色法、镀银染色法等对中枢及外周神经系统的结构做了大量的研究工作，但由于技术方法的限制，对神经递质的性质无法确定。1949年Koelle建立了胆碱酯酶染色法（cholinesterase staining method, ChE）1964Rh ，Karnovsky 和Roots在此基础上改良并建立了一步完成的乙酰胆碱酯酶（Acetycholinesterase,AChE）直接染色法，使显示胆碱能神经成为可能。从生物测定来看，AchE和胆碱能神经的标志酶存在平行关系。因此，一般认为，在加用乙酰胆碱酯酶抑制剂的情况下，用Ache 显示胆碱能神经，仍不失为一种简便易行、可信的技术方法。但必须指出的是，一些接受胆碱能神经支配的细胞（称为胆碱能敏感细胞）和一些非神经细胞（如红细胞和骨骼肌）也可呈AchE阳性反应，甚至中枢神经系统内去甲肾上腺素（NA）能神经元集中的部位—蓝斑也呈现AchE阳性反应。因此，AchE阳性反应的不能就简单地确定为胆碱能神经元或神经。 50年代，Eranko就已发

一、抗体的制备和配制 （一）抗体的制备 这是免疫细胞化学技术的首要试剂，必需制备具有很高特异性和敏感性的高效价抗体，这将在本书第二章　中详述。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，许多实验室直接应用市售产品，现在我国自制抗体种类少，发展抗体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质，能够自制较好。 （二）抗体的配制 包括抗体贮存液和抗体使用液的配制方法。新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。 1．抗体贮存　　获得新抗体后，应先根据生产厂家提供的抗体效价，将其分装，可每10μl或100μl/支分装入安瓿或0.25ml带盖塑料管中，密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存备用，一般可保存1~2年。小量分装的抗体可1次用完，避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间保存，在4。C可存入1~3天，超过7天效价显著降低。 2．抗体使用液的配制　　这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环，无论是一抗、二抗和各种标记抗体，用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少，稀释使用的各种抗体原液，