丁召兴1 　田洪根2 1. 滨州医学院附属医院 256603 2. 滨州市药品检验所 256618 [ 摘要 ] 从逆转录酶和前病毒学说的创立，逆转录病毒逐渐从一种致瘤病毒发展至作为基因转移的载体用于基因治疗的研究 , 医学科学的进步正在使看似不可能的事情变为现实。然而，目前国内外仍不能找到一种满足临床治疗需要的兼顾安全与高效的载体系统，这也使得基因治疗的进程举步维艰。随着科学的发展，可试用的构想不断产生，相信人类终将攻克难关，使基因治疗造福于人类。 载体、转导基因、靶细胞是基因疗法的基本组成元件，基因治疗是将外源性目的基因导入体细胞以纠正遗传或获得的基因缺陷。将目的基因导入靶细胞实现基因治疗的过程中，载体起着至关重要的作用。自从 1990 年开始了世界上首例基因治疗以来，这一曾被奉若神明的科学新贵的发展并非一帆风顺，而是屡遭挫折，人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。事实上，各种类型的基因转移载体在安全性和有效性的问题上不能满足人类顽症基因治疗的需要，其中应用最多的逆转录病毒载体系统的完善，无疑依赖于基础研究的突破。

摘要 基因转染是基因治疗的关键步骤之一。目前所采用的转染技术主要是病毒载体系统和非病毒载体系统，它们各有优缺点。病毒载体转染效率比较高，但其免疫原性大、靶向性差，并有着潜在的致瘤性。非病毒载体安全性和靶向性较好，但转染效率一直欠佳。因此，寻求一种理想的转染方式，将二者的优势相结合，使目的基因靶向、安全并高效的整合到靶细胞基因组，是基因治疗成功的关键。随着纳米技术和磁性材料在医学上的应用，一种新型的基因转染技术—磁性转染(magnetofection)应运而生。它是一种将目的基因分子与磁性纳米微粒结合形成磁性微球，利用外加磁场力的导向作用使其高效靶向的转运到靶器官，发挥治疗作用的方法。本文将就磁性转染技术的原理、优点以及所面临的问题做一综述。 关键词 磁性转染 基因治疗 转染效率 纳米微粒 前言 1990年，人类对腺苷酸脱氨酶（ADA）缺陷所致的先天性免疫缺陷综合征进行了历史上首例基因治疗，并取得一定疗效。十余年来，基因治疗作为一种很有潜力的治疗手段，为许多疑难病症带来了希望。但它依然面临着许多问题和困难

一 背景 基因治疗通常是指把遗传物质（DNA或RNA）引入到患者的细胞中，以达到治疗疾病的目的。它是伴随着基因工程技术和分子生物学的发展而逐渐形成的一种新型“分子治疗”手段。1990年9月，美国科学家Anderson博士等人进行了首例基因治疗的临床试验。到目前为止），全世界范围内已经批准进行了400多个临床试验方案。1991年，复旦大学的薛京伦教授研究小组进行了我国第一例基因治疗临床试验，说明我国在此研究领域起步较早。人类基因组的DNA序列工作框架图的完成，标志着功能基因组时代的到来，人类对自身基因的功能特别是与疾病相关的基因的了解将大大加快。这对基因治疗的研究无疑会产生巨大的推动作用。虽然目前基因治疗在有效性、可操作性和安全性等方面面临着不少问题，但我们有理由相信在不远的将来必会产生突破性的进展，并带来具有深远意义的医疗革命。在基因治疗的研究中，基因导入系统是最关键的技术。本文试对基因治疗载体应用的原理、种类和研究现状分几方面做简要介绍。 二 病毒性载体 外源基因进入细胞中通常需要“运输工具”。病毒是在漫长的自然进化过程中存活下来的没有细胞结构

　　引言：小干扰RNAs(small interfering RNAs，siRNAs)是RNA干扰(RNA interference，RNAi)过程中的效应分子.Fire et al[1]在1998年向秀丽隐杆线虫中注射双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子后降解了细胞质中含有同源序列的靶mRNA.随后的研究表明，RNAi现象广泛存在于真菌、拟南芥、斑马鱼、果蝇、小鼠及大鼠等大多数真核生物中.早期在哺乳动物细胞中应用长dsRNA可引起非特异性干扰素反应而导致细胞死亡，后来遗传学和生物化学研究证明将dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNAs后不引起干扰素反应，并能有效降解含有同源序列的靶mRNA.因此，siRNAs正迅速发展成为研究基因功能的新工具和作为治疗的新手段. 　　1、siRNAs的沉默机制 　　siRNAs是由RNase-III家族中被称为Dicer的核酸内切酶在细胞质中剪切自然存在的长dsRNA的过程中产生的.Dicer将长dsRNA剪切为21-28个核苷酸的siRNA双链.这种si

吴小兵博士 中国CDC病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室（副研究员） 本元正阳基因技术股份有限公司/863计划 生物 领域病毒基因载体研发基地（技术总监） (2004年4月） 一、基因治疗回顾 早在１９６８年，美国科学家迈克尔·布莱泽在的文章，首次在医学界提出了基因疗法的概念。但直到１９９０年，人类才首次进行了相关临床试验。美国FrenchAnderson于1990年9月进行了逆转录病毒载体介导的腺苷脱氨酶（ADA）基因导入人自身T淋巴细胞扩增后输回患者体内，取得了确切的治疗效果。成为世界基因治疗历史上标志性的事件，拉开了基因治疗研究和开发的序幕。 基因治疗首次提出了将遗传物质导入体内来治疗人类疾病的概念。一方面，它的实现将为医学带来革命性的进步；另一方面，基因治疗无论从技术上还是伦理学上都涉及到许多新概念、新问题和新挑战。因此，从一开始基因治疗就引起了学术界和产业界乃至公众的极大热情和关注，同时也一直伴随着疑问和争议。1990年至今已开展了600余项基

当前，人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移，一个以基因组功能研究为主要内容的所谓“后基因组时代”(post-genomics)，也即功能基因组(functional genomics)时代，即将到来。如何获取基因的功能信息，即与人类重大疾病和重要生理功能相关的基因信息，就摆在了我们面前。定位候选克隆策略(positional candidate cloning)是传统定位克隆(positional cloning)的改进和发展，并以其在克隆疾病相关基因中的有效性而日益受到重视。 　　人类基因组计划已确定了一系列分布于全基因组24条染色体上的分子标记。根据这些分子标记的序列和定位信息，结合杂交或PCR的方法可以快速检测染色体上与肿瘤或遗传性疾病相关的热点位置，进而从中克隆疾病相关基因。定位候选克隆克服了经典的定位克隆纯粹依靠连锁分析进行染色体定位的繁冗而缓慢的弊端，大大加快了克隆工作的进程，而且它也不仅仅局限于遗传病，现在已更多地运用于肿瘤易感基因的克隆工作。1994年国际上开始构建并于1996年首次公布的基因图谱是一个以cDNA为基础的STS(s

钱其军1，3 刘新垣2，3 吴孟超1 1第二军医大学东方肝胆外科医院 2中科院上海生化及细胞所 3浙江理工大学生命科学院 一、前言 在人类疾病中，恶性肿瘤是威胁人们的常见病，也是人类生命的主要“杀手”之一，因此癌症的治疗始终是人类十分重视的大课题。传统的放、化疗存在抗肿瘤能力低、杀伤指数过小、副作用大等一系列缺点。为了增加疗效减少毒性，人们提出“介入”治疗和定向放疗的方法，希望能以此达到特异性杀灭癌组织的目的，但由于肿瘤的一些微小转移灶难以被检测到，这种物理学方法对肿瘤的靶向治疗非常有限。 随着对于肿瘤细胞信号传导的途经的研究不断深入，人们对肿瘤细胞内部的癌基因及抗癌基因相互作用以及肿瘤微环境的影响己越来越清楚，特别最近人们逐渐到肿瘤细胞中可能存在一群具有类似干细胞功能的细胞，这群细胞虽然数量很小，但肿瘤的发生、发展、复发及转移中起重要作用。因此，针对肿瘤的特异性分子靶点的设计抗肿瘤治疗新方案，具有针对肿瘤治疗特异性强，效果显著，基本上不损伤正常组织，这种肿瘤靶向治疗是肿瘤治疗中最有前景的方案。目前肿瘤靶向治

目录 一、 生命科学中的“钓鱼”（ FISH ）技术 二、 显微镜基础知识及显微照相技术 三、 Qbiogene 荧光原位杂交的新型探针 研究用探针 a 、人卫星 DNA 直接染色探针 b 、人染色体着色探针 c 、人端粒特异特 DNA 探针 d 、小鼠染色体探针 e 、微切除探针 f 、特异性位点探针 临床用探针 a 、产前诊断 b 、肿瘤，血液病及其他疾病 四、 荧光标记 试剂 及 试剂 盒 a 、标记试剂 b 、检测试剂 c 、荧光标记试剂盒 五、 显微镜滤镜 六、 荧光原位杂交相关设备 一、生命科学中的“钓鱼”（ FISH ）技术 荧光原位杂交技术（ fluorescence in situ Hybridization,FISH ）

基因组序列的迅速获得推动了一门新兴学科——功能基因组学的发展，这一学科重点关注基因功能的变化。扩增性片段长度多态性（Amplified restriction fragment length polymorphism，AFLP）分析以及反向遗传学都是功能基因组学的重要组成部分。 传统的反向遗传学，例如用转座子（transposon）敲除特定基因，虽然可以准确测定表型，但需要进行耗时的转基因或复杂的组织培养。而且由于这种基因敲除的方法将整个基因敲除，无法观察到活性基因功能部分缺失的结果。 为克服此基因敲除方法的局限性，进一步获得关于活性基因突变的信息，Fred Hutchinson癌症研究中心的研究者们发明了一种定向诱导基因组局部突变（TILLING： Targeting Induced Local Lesions In Genomes）技术。该方法具有简单高效的特点，它利用化学突变方法来获得所有基因的传统的点突变等位基因系列。对那些表型分析时会牵涉到亚致死等位基因的重要基因，TILLING的方法具有其独特的优势。随着TILLING方法有效应用到越来

DNA分子标记在植物 生物 技术中的应用 遗传标记概述 DNA分子标记概述 DNA分子标记的主要类型 DNA分子标记在植物 生物 技术中的应用 PCR技术及在植物分子生物学中的应用 利用RAPD分子标记对三组三系杂交水 稻及亲本的遗传分析和鉴定 遗传标记概述 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。 遗传标记的发展 DNA分子标记概述 DNA分标记是近年来发展起来的一种分子生物学新技术。 在经典遗传学中通常将可识别的等位基因称为遗传标记，其类型主要包括形态标记、细胞学标记和同工酶标记。这些遗传标记在遗传学的建立与发展过程中起了重要作用，但这三种标记的数量较少，且都是以表现型为基础的，

由于常规的连锁分析（linkage analysis）是利用单分离群体，只用两个亲本，所以在一次研究中只能检测两个或四个等位基因。而且选择要在性状上尽可能差别明显的亲本，以提高检测到主效基因位点分离的机率。这种方法不能检查整个种质群体中的全部遗传变异，不能在一次测验中研究多个不同的性状。 联合作图 （association mapping）也称连锁不平衡作图（linkage disequilibrium mapping，LD mapping），是鉴定数量性状位点的有用工具。在联合作图方法中，不管潜在的家族关系，而是在一个大的种质池中查找基因型和表现型之间的统计学联合关系。基于在基因位点在的两个相邻的等位基因间的历史关系来鉴定影响某个性状表达的基因位点。 由于减数分裂过程中会发生基因重组，最初两个相邻等位基因的发生的共重组在群体中会逐步衰退。因此，未知基因和邻近的标记之间的相对等位基因分布将是非随机的，换言之，它们的分布是不平衡的。与连锁作图不同，联合作图研究可用现有的所有植物种系进行，但又不用杂交和检测后代。利用这种方法，可在一次研究中观察到所有性状

目的基因序列与载体连接后，要导入细胞中才能繁殖扩增，再经过筛选，才能获得重组DNA分子克隆，不同的载体在不同的宿主细胞中繁殖，导入细胞的方法也不相同。 一、转化 　　由于外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在1943年，Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。但DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷CaCl 2 的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4℃转入42℃作短时间处理，质粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔（electroporation）转化法。 二、感染 　　噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染（infection）。用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，以其DNA与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将

目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。以下就常用技术的基本原理加以介绍。 一、根据重组载体的标志作筛选 　　最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含

李振宇综述　徐开林　潘秀英审阅 徐州医学院附属医院血液科(徐州, 221002) 　　摘要　慢病毒载体目前是基因治疗中研究较多的载体, 与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较, 它有感染非分裂期细胞及容纳外源性目的基因片段大等优点。对其结构的优化主要集中在提高 生物 安全性、提高转基因表达、转基因表达的调控及载体靶向性等方面。本文介绍了慢病毒载体构建及结构优化方面的研究进展作一综述。 关键词　慢病毒载体; 载体构建; 结构优化 　　目前基因治疗中目的基因的转移工具多采用病毒载体, 其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为常用。由于逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞, 容纳外源基因的DNA 片段长度不超过8 kb; 腺病毒载体感染细胞时, 病毒DNA 游离在细胞核内, 并不整合到染色体上, 在体内不能实现稳定的长期表达, 且反复应用容易引起免疫反应。以人类免疫缺陷病毒21 (H IV 21) 来源的慢病毒载体越来越受到人们的重视[ 1 ]。研究发现慢病毒载体最大的特点是可以感染非分裂期细胞, 人们已成功地应用

【摘要】　慢病毒(lentivirus) 具有可以感染低分裂细胞的独特优势,且基因转移效率高,操作相对简便,在多种疾病的基因治疗、转基因动物的制备等方面成为引人瞩目的病毒载体。本文就慢病毒载体(lentiviral vector ,LV) 的特点、构建、应用,尤其是慢病毒载体对于肝细胞的基因转移进行综述。 【关键词】　慢病毒载体;肝细胞 　疾病的基因治疗目前已引起越来越多的重视。在基因治疗中一个重要的方面即是基因转移载体的选择。目前选用的载体有病毒载体和非病毒载体, 尤以病毒载体应用更为广泛,如致癌逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等。其中慢病毒 (lentivirus) ,尤其是经过改构的慢病毒,因其独具可感染低分裂细胞的特点,且基因转移效率高,操作相对简便,已成为当前基因治疗中载体研究的热点。本文就慢病毒载体(lentiviral vector ,LV) 的特点、构建、应用,尤其是慢病毒载体对于肝细胞的基因转移进行综述。 一、慢病毒载体 (一) 慢病毒载体概况 慢病毒是逆转录病毒科的一个亚科,包括灵长

实验五 果蝇遗传性状系列杂交实验 【系列杂交实验内容】 　　1.果蝇的单因子实验杂交组合 18 # ♀ x 2 # ♂ (正交） 2 # ♀ x 18 # ♂(反交)。 　　2.果蝇二对因子自由组合实验的杂交组合 e♀ x 2 # ♂ (正交) 2 # ♀ x e # ♂ (反交) 。 　　3.果蝇的伴性遗传杂交组合 18 # ♀ x 22 # ♂ (正交) 22 # ♀ x 18 # ♂ (反交) 。 　　每3位同学一组，互相协作，共同完成以上实验。 【试

一、实验目的 1．掌握利用系谱与DNA检测所得到的信息相结合用于产前基因诊断的方法； 2．了解DNA分析技术在遗传病产前基因诊断中的应。 二、实验原理 （一）PCR-RFLP分析技术 PCR-RFLP分析技术是在PCR技术基础上，根据限制性内切酶识别位点改变而导致的酶切位点增加或消失的特点，对DNA进行鉴定；利用PCR特异扩增的 DNA片断中包含某个碱基突变，经特定限制酶切割后, 通过凝胶电泳分离酶切产物大小，比较分析与对照样本的异同，判断该DNA是否存在突变。应用PCR-RFLP分析技术可以检测已知的点突变，也可以在家系中连锁分析进行基因诊断。 （二）FⅧ基因 FⅧ基因位于人类染色体Xq28，长186kb，由26个外显子及25个内含子组成。根据FⅧ基因序列，本实验利用PCR结合RFLP设计了一对特异性引物，首先扩增出FⅧ基因长度为142bp的特异性片段，然后选择 Bcl Ⅰ限制性核酸内切酶对扩增产物进行消化，野生型基因拥有限制性核酸内切酶 Bcl Ⅰ的酶切位点，可被切为99bp和4

一、实验目的 1、了解动物细胞染色体制片的原理。 2、学习蛙骨髓细胞染色体制片的方法。 3、观察蛙染色体的数目和形态。 二、实验原理 小型动物染色体制片最好、最有效的材料就是骨髓组织。在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，可直接得到中期细胞。为提高有丝分裂指数，实验前，于动物腹腔内注射一定量的秋水仙素溶液，取骨髓后，经低渗处理、固定、滴片、空气干燥后即可获得良好的中期分裂相。 三、实验材料、 蛙类 四、器具及药品 注射器， 离心管 、解剖器、离心机，冰箱、电子天平，显微镜，搪瓷缸，载玻片，烧杯，滴管，秋水仙素，KCl，甲醇、冰乙酸，乙醇。 五、实验步骤 ㈠离心法（适合于个体大的蛙） 1、前处理 目的：改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤体的形成，使染色体缩短和分散，获得较多中期分裂相。 实验前8-20小时，将蛙称重，按每克体重10-40ug的剂量（无尾类10-20ug，有尾类30-40ug）经腹腔注射秋水仙素溶液，秋水仙素溶液浓度100-1

一、实验目的 1、了解染色体显带技术的发展与基本知识； 2、掌握染色体C带技术。 二、实验原理 所谓染色体显带技术指借助特殊的处理后，再用染料对染色体进行分化染色，使其呈现特定带纹的一种细胞遗传学技术。如C带、G带等。显带处理后，染色体上带纹的数目、位置、宽窄与染色的深浅具有相对的稳定性与一定的种属特异性。它为不同物种之间的进化关系的研究提供了一个有效手段。C带是特异的显示结构异染色质的带，它专一地显示着丝粒区域的结构异染色质。 三、实验材料 实验五与实验二制备的染色体玻片标本若干片 四、器具及药品 显微镜，电子天平，恒温 水浴 锅，玻片架，解剖器，染色缸，白瓷板，氢氧化钡，盐酸，氯化钠，柠檬酸钠，吉姆萨，磷酸缓冲液。 五、实验步骤 ㈠BSG法显示C带 1、将3-7天的实验5染色体制片放入0.2mol/l的盐酸中处理1小时。 2、蒸馏水冲洗后，转入50℃的5％的氢氧化钡溶液中5-15分钟。时间由经验得来。 3、同温蒸馏水冲洗，直至氢氧化钡冲净

一、实验目的 1、了解果蝇生活史及各个阶段的形态特征； 2、了解果蝇常见突变型的特征及鉴别雌雄果蝇的方法； 3、掌握实验果蝇的饲养管理以及实验的处理方法和技术。 二、实验原理 作为遗传学研究的材料，果蝇具有非常突出的优点：果蝇形体小，生长迅速，繁殖率高，饲养方便；世代周期短（约12天即可繁殖一代）；突变性状多；染色体数目少，基因组小；实验处理十分方便，容易重复实验，便于观察和分析。 三、实验材料 黑腹果蝇 四、器具及药品 显微镜，放大镜，白瓷板，毛笔，培养瓶，麻醉瓶，解剖器，纱布，药棉，棉线， 琼脂 ，玉米粉，白糖，酵母粉、丙酸，乙醚，乙醇 五、实验内容和步骤 ㈠果蝇生活周期的观察 果蝇是完全变态昆虫，生活周期可分为明显的4个时期：卵、幼虫、蛹和成虫。 1、卵 在25℃时，羽化后的雌蝇一般在8小时后开始交配，两天后开始产卵，卵长约0.5mm，白色，形状长椭圆形，在其背面前端有两条触丝，触丝可使卵附着在食物（或瓶壁）上，不致深陷进食物中