一、培养细胞的常规观察 培养细胞在体外的生长过程是一个动态的连续过程，细胞的数目、形态以及培养基的颜色、澄明度等在一定程度上都是细胞生长状况的表现。借助于肉眼或显微镜的帮助，通过对上述常规指标的观察，可以有效地帮助我们及时把握细胞的生长信息，适时、适当采取相关措施培养好细胞。 （一）培养基的观察 培养基的颜色和澄明度是肉眼观察的两个重要指标。新鲜的培养基一般呈现桃红色，pH值约为7.2-7.4，培养过细胞后的培养基由于含有大量细胞代谢产物而使得pH值降低，颜色也逐渐变黄。培养基颜色的这种变化是由其所含有的酚红指示剂来显示的，酚红会随溶液的pH值变化而改变颜色，成为指示培养基pH值的最直观指标。培养基颜色变黄是细胞需要换液的信号。一般情况下，大多数细胞需要每2-3天换液一次。需要注意的是，如果细胞在换液或传代后培养基很快就会变黄，这可能是细菌污染或培养瓶不干净造成的。 正常情况下，无论颜色如何变化，培养基都能保持澄明。一旦发现培养基变混浊，就应注意是否有污染发生。上市情况多适用于贴壁生长的细胞，对于悬浮生长的细胞来说，随着细胞密度的升高，培养

关于衰老机制的假说很多，而这些学说间又相互重叠、相互补充，甚至有些学说非常相似，例如有一种“DNA修复说”就与“体细胞DNA突变说”大同小异，只不过前者重点在于细胞防御体系而不在于损伤本身。再有“蛋白错误假说”与“体细胞DNA突变说”又相互重叠。由此，我们需用各种学说才能大致把握衰老机制的全貌。 一、遗传决定说 众所周知，在一定环境条件下，一个种内所有个体的寿命非常一致， 例如一个特殊品系大鼠的群体寿命为三年；果蝇只能活三十天；而人的最长寿命可达一百多岁。最高寿限是指一个种的潜在可能的寿命，但在野生或在不加控的条件下，或在不同的环境中，不是一个种内的所有个体都能活到最高的寿限。事实上，人类的平均寿命远低于最高寿限，但是随着 生物 学及医学的不断进步，剔除战争及自然灾害等因素，人类的寿命可以得到不断的延长。统计数据表明，人类的寿命在过去的几十年来有明显的延长，越来越接近人类的最高寿限，但是人类作为一个种属，必定存在着它的生命极限，这正是由人类的遗传物质基础所决定的。 人们都有这种体验，长寿双亲的子孙寿命比平均寿命要长。还有，女性的平均寿命高于男

任何生命都有终结，细胞死亡（cell death）与细胞生长、分化、增殖一样，都是细胞生命活动的正常组成部分。引起细胞死亡的因素很多，但不外乎内因和外因两种。内因通常是指由于衰老所导致的自然死亡，而外因则指外界环境的各种因子超过了细胞所承受的强度及阈值，对细胞造成的损害。根据细胞死亡的模式不同，可分为坏死（necrosis）和凋亡（apoptosis）两种类型。 一、细胞死亡概念的发展 近二十年来，在细胞死亡领域的知识发展很快，在这迅猛的发展过程中，一系列的如“凋亡”等的新名词相继出现。而诸如“坏死”之类的早已存在的概念又被赋予了新的含义。尤其是细胞死亡的两种重要模式“坏死”与“凋亡”，被普遍认为是极易被混淆的两个基本 生物 学概念。 远在1858年的时候， 由于组织学染色的方法没有采用，人们对细胞死亡的了解限于一个粗略的水平，只能从宏观上将它们称为“退化、软化、坏死以及坏疽”等等，主要的根据往往是依靠它们的外在表现。曾有学者使用“坏死”这个概念描述组织的解体，也就是我们现在通常说的“坏疽”。可以这样理解，若“坏疽”部分不同程度地保持原有的外

一、死亡受体介导的细胞凋亡 死亡受体属于肿瘤坏死因子基因家族，其共同特征是都有相似的、富含半胱氨酸的细胞外结构域。 死亡受体还有一个同源的、称为死亡结构域的胞内序列。死亡结构域一般使死亡受体与胞内凋亡机制相连，但它们有时也会介导与凋亡无关或抑制凋亡的过程。 （一）FasL-Fas 系统介导的细胞凋亡 自杀相关因子Fas（factor associated suicide）是广泛表达于正常细胞和肿瘤细胞膜表面的I型受体，其胞浆段内含有60～80个氨基酸组成的死亡结构域（death domain，DD）及阻抑域（suppresive domain，SD）。FAS的阻抑域（SD）被Fas结合磷酸酶-1（fas-associated phosphatase-1，FAP-1）结合后可抑制fas的诱导凋亡作用。 Fas的配体FasL（Fas ligand）主要表达于T效应淋巴细胞和肿瘤细胞，是呈现于膜表面的II型受体。Fas和FasL都是以纯三聚体形式存在，在FasL同靶细胞膜表面的Fas结合后，诱导Fas胞浆段内的死亡域（DD）结合Fas结合蛋白FA

生物 体内的细胞增殖和凋亡在正常情况下处于动态平衡，如果细胞增殖过多或凋亡减少,就会导致细胞过剩性疾病；如果增殖减少或凋亡增加，就会导致细胞减少性疾病。凋亡研究将为人类某些重大疾病的防治提供新策略。 一、细胞凋亡减少和细胞存活增加的有关疾病 这类疾病主要有癌症、自身免疫病、某些病毒病，以及结肠息肉等疾病。过去只重视细胞增殖所造成的疾病，自从细胞凋亡概念提出后，人们开始重视细胞凋亡与疾病的关系。 （一）肿瘤 过去将肿瘤说成是“增生性疾病”，但现在的证据却表明肿瘤细胞凋亡调控对于肿瘤发生具有非常重要的作用。一般肿瘤细胞高表达FasL，借以凋亡淋巴细胞，而又低表达Fas，而降低凋亡。这就形成肿瘤细胞有逃避免疫及凋亡耐受的特性。虽然肿瘤的形成与其增殖及凋亡两方面异常都有关，但是肿瘤细胞的凋亡反应总是呈现相对较低。 （二）自身免疫病 身免疫病:细胞凋亡在免疫系统发育和自我调节中起关键作用，90%以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会凋亡，只有少数细胞才能生存下来，这样才能保证被选择生存下来的淋巴细胞不对自身抗原产生免疫应答反应，而那些

实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl 2 法制备及质粒转化。 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl 2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-，M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl 2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生

细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。 1． 冻存细胞 （1）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前1d换液。 （2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×10 7 ／ml左右密度，离心，去上清。 （3）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO)或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。 （4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m悬液。 （5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。 （6）冻存：在特殊的 仪器 或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促

1.实验原理　人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead提出来的。正常情况下，人外周血小淋巴细胞都处在G1期（或G0期），但在体外给予一定的条件，进行培养，经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。 在培养液中加入植物血凝素（PHA），淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，使细胞分裂停止在中期，同时它可改变细胞质的黏度，引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定，即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1ml外周血中一般含有约（1～3）×10 6 个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。本节介绍人外周血淋巴细胞的悬浮培养法，以及染色体标本的制备。 2. 试剂 与器材 （1）2ml注射器、培养瓶、刻度吸管，需15磅灭菌20min。离心管、吸管、量筒、载玻片，经洗液按常规清洗、烘干备用。 （2）超净工作台，恒温培养箱，天平，离心机、显微镜等。 （3） 试剂 ： ① 培养

植物细胞培养是指在离体条件下培养植物细胞的方法。将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体。小规模的悬浮培养在培养瓶中进行，大规模者可利用发酵罐生产。 植物细胞培养是在植物组织培养技术基础上发展起来的。1902年Haberlandt确定了植物的单个细胞内存在其生命体的全部能力(全能性)，使成为植物组织培养的开端。其后，为了实现分裂组织的无限生长，对外植体的选择及培养基等方面进行了探索。20世纪30年代，组织培养取得了飞速的发展，细胞在植物体外生长成为可能。1939年Gautheret，Nobercourt，White分别成功地培养了烟草、萝卜的细胞，至此，植物组织培养才真正开始。50年代，Talecke和Nickell确立了植物细胞能够成功地生长在悬浮培养基中。自1956年Nic-kell和Routin第一个申请用植物组织细胞培养产生化学物质的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生物质的研究取得了很大的进展。随着生物技术的发展，细胞原生质体融合技术使植物细胞的人工培养技术进入了一个新的

转染技术是指将外源分子如DNA，RNA 等导入真核细胞的技术。随着分子 生物 学和细胞生 物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因 功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等 生物 学试验中，其应用越来越广泛。影响转 染效率的因素有很多，细胞株本身的特性和活性， 细胞培养 条件，转染的DNA 或RNA 的质量， 转染方法，转染试剂的选择等。 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表 达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些 报告系统如荧光蛋白，β - 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可 以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。外源DNA 整合到染色体中概

1. 器皿洗涤 玻璃器皿洗涤 ：新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%的HCl溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1～2次，干燥后即可使用。已使用过的试管、烧杯、三角瓶等的洗涤方法是，先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用合成洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1～2次。用过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品，需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗半小时左右，再用蒸馏水冲洗1～2次，然后烘干或晾干。载玻片和盖玻片容易破碎，洗涤时不宜用力擦洗，其洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时，取出后用清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。 塑料用品洗涤 ：塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤 ：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，并保持干燥。 2. 培养基配制 2.1 母液配制 为工作方便起见，常用培养基通常先按配方

1. 愈伤组织诱导 1.1 实验材料：烟草无菌苗叶片 1.2. 诱导培养基：MS附加NAA2.0mg/L，BA2.0mg/L，蔗糖20g/L， 琼脂 6-7g/L，pH调整至5.8。 1.3. 设备及工具： 超净工作台 ；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。 1.4 接种操作方法 用75%乙醇将净化工作台擦洗干净，将接种所用的材料、工具、培养基等准备好放入工作台。打开紫外灯和风机至少15分钟后开始操作。 a. 在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入 超净工作台 开始接种操作。 b. 关闭紫外灯，点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。 c. 取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种4-5小片。 d. 快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。 e. 接种后的三角瓶置于24℃条件下，黑暗培养一周，然后在同样温度下分为

一． 实验目的： 掌握染色体组型分析方法，分析染色体组型计算有关数据。 二． 实验原理： 一个二倍体植物的配子的全套染色体，称为一个染色体组。各种动植物的体细胞，都有其特定的染色体组型。染色体组型或称为核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括这一组染色体的数目、大小、形态、着丝点位置以及付溢痕、随体的有无等。染色体组型分析就是对染色体组中的染色体作上述各种形态特征的描述。 三． 实验方法及步骤： 1．测量：在已放大的照片上对染色体进行测量和描述，记录染色体形态测量数据，如下： 臂率=长臂/短臂 着丝粒指数=短臂/该染色体长度 总染色体长度=该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和 相对长度=每一个染色体的长度/总长度 2.配对：根据测量数据，即染色体相对长度、臂率、着丝粒指数、次溢痕的有无及位置、随体的性状和大小等进行同源染色体配对。 3.染色体排列：染色体对从大到小，短臂向上、长臂向下，各染色体的着丝粒排在同一条直线上。有特殊标记的染色体（如含有随体

刘进平 （华南热带农业大学农学院 海南儋州 571737） 摘要 本文对影响基因受体选择的几个因素如基因转化方法、受体的再生能力、受体材料的生理状态和再生途径，以及体细胞无性系变异的发生进行综述。 关键词 遗传转化，基因受体，体细胞无性系变异 SELECTION OF GENE RECEPTOR IN PLANT TRANSFORMATION Abstrcat Factors influencing the selection of gene receptor in plant transformation such as transformation methods, regeneration capacity of gene receptor, physiological state of gene receptor, regeneration methods and occurrence of somaclonal variation were reviewed. Key words Plant transformati

一、实验目的 1．学会染色体组型的分析方法 2．学会显微摄影技术 二、实验原理 各种生物的染色体数目是恒定的。大多数高等动植物是二倍体。也就是说，每一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，在体细胞中可以不成对。每一个配子带有一组染色体，叫做单倍体细胞，用n表示。两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞。如蚕豆的体细胞2n＝12，它的配子，n＝6，玉米的体细胞2n＝20，配子n＝10。水稻2n＝24，n＝12。有些高等植物还是多倍体，即在体细胞中含有三个或三个以上的染色体组。 正常细胞中的染色体染色体在复制以后，纵向并列的两个染色单体，往往通过着丝粒联在一起。着丝粒在染色体上的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂，各染色体的长臂与短臂之比称为臂率。造成中间着丝粒染色体，亚中间着丝粒染色体、亚端部着丝粒染色体和端部着丝粒染色体等形态不同的染色体类型。此外，有的染色体还含有随体或次级缢痕。所有这些染色体的特异性构成一个物种的

多倍体广泛分布于植物界，如普通小麦是异源六倍体，棉花是四倍体，栽培草莓是八倍体等，多倍体产生途径除自然发生外，化学药剂诱导是很有效的途径。不管以何种方式产生，检测、鉴定多倍体就显得很重要和迫切。 鉴定多倍体，可采用间接和直接的方法。间接方法包括形态学和细胞学的观察，直接法是直接对试材检测染色体的数目。一般来讲，多倍体植物在形态学和细胞学上的特征表现为: 气孔、花器、花粉粒、种子、果实甚至叶片等明显变大，单位面积叶片上的气孔数目减少而密度降低等。考虑到染色体观察、记数较为烦琐，首先对试材从形态学和细胞学上来初步判断是否为多倍体，然后把初步断定为多倍体的试材再观察、记录染色体数目是否真正地发生了倍性的变异，从而最终确定为多倍体。 芽变选种是无性繁殖植物育种的一种有效途径，多以嵌合体的形式存在，特别是多倍体芽变。通过检测梢端分生组织LⅠ、LⅡ 、LⅢ三层细胞的细胞、细胞核及核仁的大小，可以鉴定芽变材料倍性嵌合体的类型。 本实验学习多倍体鉴定的基本方法。 一、试材及用具 1．试材:玉米、小麦、棉花、草莓、番

实验原理：细胞中的DNA受1NHC1，60℃水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff） 试剂 中，希夫 试剂 即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。这个反应是Feulgen在1942年提出来的，是DNA的一个特异性检查法。 水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，漂呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。 希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液，呈无色。与DNA醛基反应后，使碱性品红恢复原来的红色。 二、实验目的：观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。 三、实验材料：上次实验制成了石蜡切片。

一、实验原理 同一条染色体上的遗传因子（基因）是连锁的，而同源染色体基因之间可以发生一定频度的交换，因此在子代中将发现一定频度的重组型，但一般比亲组型少得多。遗传学上以重组百分比作为这两基因之间的距离（除掉％）。重组高说明二基因相距远，重组低说明二基因相距近。但需要指出的是雄性果蝇没有交换，因此只能用雌果蝇的重组值作为某二基因的距离。 二、实验目的 1.理解连锁和交换的原理 2.学习实验结果的数据处理和重组值求法 三、实验材料 黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）的品系 野生型（灰体、长翅），wildtype［++］ 双突变型（黑体、残翅），doublemutant［bvg］ 四、实验器具和药品 实验工具和药品见实验四（果蝇的伴性遗传）。 培养基以及配方见附录一（果蝇的饲养）。 五、实验说明 1.性状特征：双突变型果蝇黑体残翅（bvg），无论雌、雄它们的体色比正常野生型黑得多，翅膀几乎没有，只有少量的残痕，因而不能飞，只能爬行。基因都在第二染色体上，（b）的座位是48.5，（vg）的座位是67.0。正常的野生

一、实验原理 有些性状，如身体大小、生长速度等，可用某种尺度来测量，由数字来表示，这样的性状叫做数量性状（quantitativecharacter）。数量性状大都由很多基因支配，其中每个基因的作用很小，但有关的基因数目很多，又受到环境的影响，所以它们的表型呈连续分布。在这种情况下，用通常的遗传学方法追查各个基因的行为是困难的。因此，在数量性状的遗传学分析方面，应用统计遗传学方法。 二、实验目的 以黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）腹部着生的小刚毛数为对象，研究数量性状遗传的特点。学习估计统计遗传学基本参数之一——遗传率（heritability）。 三、实验材料 黑腹果蝇：实验室中维持多年的系统，因近交系数高，缺乏遗传的变异，所以不合适。应该利用野外采集的果蝇，或把两个不同的实验室品系杂交，再把F 1 个体相互交配，利用它们的F 2 代。培养供试果蝇时，幼虫期避免过密，在20℃左右、稍稍低温下饲养，这样成虫个体大，容易观察和计数。 四、实验器具和药品 双筒显微解剖镜（×40—60），照明装置

一、实验原理 粗糙链孢霉（Neurosporacrassa）属于真菌中的子囊菌纲。它是进行顺序排列的四分体的遗传学分析的好材料。粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分生孢子中含有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这是粗糙链孢霉的无性生殖过程。 粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型（matingtype），用A、a或mt + 、mt - 表示，它们受一对等位基因控制。不同接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，这过程称为有性生殖。有性生殖可以通过两种方式进行： 1.当菌丝在有性生殖用的杂交培养基上增殖时，就会产生许多原子囊果，内部附有产囊体，若另一接合型的分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的产囊体中，形成接合型基因的异核体。进入产囊体中的分生孢子的核发生分裂，并进入产囊菌丝中，被隔膜分成一对细胞，形成钩状细胞，亦称原子囊。钩状细胞顶端细胞的二个核形成合子，合子核再进行减数