IFN-α逆转白血病细胞耐药性的实验研究 第三军医大学学报1999年第21卷第3期 张勇　张翼军　夏顺中　周成康 　　 提　要 　 目的 ：了解干扰素-α(IFN-α)逆转白血病细胞多药耐药性(MDR)的作用和可能机制。 方法 ：采用链亲和素-胶体金原位杂交(SAG-ISH)检测了IFN-α孵育前后的52例白血病患者骨髓细胞的多药耐药基因(MDR 1 )表达，用荧光分光光度法测定了IFN-α孵育前后的52例骨髓细胞内柔红霉素(DNR)浓度。 结果 ：全部52例患者中24例(46.2%)MDR 1 阳性，初治组与复发难治组相比相差显著。MDR 1 阳性者骨髓细胞内柔红霉素浓度与阴性者相差显著。IFN-α孵育后的MDR 1 阳性率与孵育前相差不显著，但经IFN-α孵育前后的MDR 1 阳性者的骨髓细胞内DNR浓度相差显著，阴性者亦然。 结论 ：IFN-α能增加白血病细胞内DNR浓度，其逆转MDR环节不在MDR 1 基因水平上，而在其他

染色体显带技术是在显示染色体基础上发展起来的技术，其优点是能显现染色体本身更细微的结构，有助于更准确地识别每条染色体及染色体异常疾病。染色体分带技术能适用于各种细胞染色体标本。 　　染色体显带是沿着整条染色体的长轴，能显现出着色深浅不同、横向走的带型。目前认为染色体显带现象是染色体结构所致。但用特殊方法处理后，再用染料染色，则带型更加清晰，随显带方法不同，显现出的带型的特点也不一样，这说明带的出现与染料的特异结合相关。人类染色体能显现出近2000个G带，这些带再融合成一般显微镜下可见的850条左右的高分辩染色体带型或350条带左右的常规带型。 常见的几咱显带方法： （一）、G带 　　也称为G显带，是最常用的显带方法，具有操作简便、经济及标本能长期保存等优点。 1、Giemsa原液的配制： 　　（1）称3.75gGiemsa粉置研磨器中，加少许丙三醇研磨，研磨越细越好； 　　（2）将研细的Giemsa加丙三醇移入500ml棕色瓶内，丙三醇的总量为250ml，用一定量甲醇洗干净研

　摘要: 目的: 观察抗癌中药“抑瘤粉”的抑癌作用。方法: 通过建立小鼠移植实体型肝 癌。结果: 抑瘤粉抗肝癌抑制率为47%～ 69%。在超微病理上, 抑瘤胶囊能破坏 由脂类、蛋白质和糖类组成的细胞膜与核膜, 使其崩溃裂解; 枯否氏细胞功能 增强, 其分泌免疫调节因子破坏癌细胞。提示: 抑瘤粉有明显的抗肝癌细胞作 用。 主题词: 抗肿瘤药　肝肿瘤　动物　实验 　　本文建立小鼠实体型肝癌模型, 观察抑瘤粉对肿瘤 的抑制作用, 超微病理改变, 从而探讨抗癌机理, 为临床 应用提供较科学的理论根据。 　　1　材料与方法 　　1. 1 材料 1. 1. 1　药物与动物　抑瘤粉由西安药厂实验研究所提供, 主要成分为马钱子、甘草。先将马钱子用白醋、赤石脂炮制, 后将两药分别打粉, 按1 ∶ 10 配制。纯系 BACBöC 小鼠由本校实验中心提供, 体重17～ 22g, 雌雄兼用。建立肝癌模型, 小鼠40 只, 随机分成

植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。 　　（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。每8-12小时摇荡一次。（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml 离心管 内，3000-4000rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。 　　（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或 蒸馏 水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动

一、实验目的 细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞均能发生自发融合现象。人工方法诱导细胞融合开始于50年，现在这项技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫，肿瘤及细胞工程的重要手段。通过实验，了解细胞融合的原理，掌握细胞融合的基本方法。 二、实验原理 在诱导物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，最后打通两质膜，形成双核或多核细胞（此时称同核体或异核体）。通过有丝分裂，细胞核便发生融合，形成杂种细胞。 三、实验用品 1. 器具 显微镜 离心机 天平 离心管 注射器 细滴管 载片、盖片 2. 试剂 50%聚乙二醇(PEG)：称取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度试管，在酒精灯火或沸水中加热溶化。待冷至50℃时，加入等体积并预热至50℃的GKN液混匀。 Alsver液：葡萄糖2.05g 柠檬酸钠0.8g NaCl 0.42g，加重蒸水至100ml。 GKN

组织细胞用于遗传学分析最常见的是体外培养的细胞株，多为恶性肿瘤细胞株，且呈贴壁生长，仅小数细胞株为悬浮生长。培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和染色体标本制出清晰度高等优点。组织细胞染色体制备的关键是掌握好体外细胞的生长动态，只有处在对数生长期的细胞才能出现较高的分裂相，所以积水仙素处理的时机及量是染色体标本形态及分裂指数的关键。 　　1、 实验材料 　　培养液（PRMI 1640、M199、DMEM等），小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素，刻度 离心管 ，直吸管及弯头吸管，培养瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、载玻片。 　　2、 培养液配制 　　培养液 85-95% 　　小牛血清 5-15% 　　双抗（选择） 100u/ml 　　3、 操作过程 （1）培养细胞：选择处于指数生长期、用大瓶培养的80-90%汇合单层培养细胞； （2）终止培养：当有大量圆形发亮细胞出现时，加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培养混合液，置温箱继续培养6-10小时以抑制分裂期细胞停止于分裂中期；（3）聚集

在真核生物中, 染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质-DNA的载体, 对生物的遗传、变异、进化和个体发生, 以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型(karyotype)或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象，并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴(Joe Hin Tjio)和瑞典学者A.Levan合作, 利用低渗法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46条，而不是前人所主张的48条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。 1.实 验 目 的 1.1 初步掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。 1.2了解常用实验动物染色体的数目及特点。通过组型实验，掌握染色体组型的基本方法 2.实 验 原 理

实验目的 观察植物细胞质流动现象,了解影响细胞质流动的因素。 实验原理 在多种植物的细胞中都能观察到植物细胞质流动现象，它是细胞活动强弱的重要指标。细胞质流动现象的产生，是细胞骨架中微丝肌动蛋白与肌球蛋白相互滑动的结果，此过程要消耗能量，受各种因素诸如温度、渗透压及各种离子的影响。 材料用品 **材料：紫鸭趾草花丝，黑藻（水王荪、轮叶黑藻）叶。 紫鸭趾草 紫鸭趾草花 黑藻 **药品：1mol/L氟化钠，1mol/L丙二酸钠，0.7mol/L 2,4﹣二硝基酚(DPN) ~undefined*~0~0~0~0仪器 ：显微镜，载玻片，盖玻片，尖头镊子，刀片 实验步骤 1.取1块载玻片，滴

1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。 3. 材料 3.1 37 oC 恒温水槽 3.2 新鲜培养基 3.3 无菌吸管/ 离心管 / 培养瓶 3.4 液氮或干冰容器 4. 步骤： 4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 4.4 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混

概述 如今越来越多的临床与细胞实验室检验项目对快速处理样品提出了更高的要求。对于样品分离的常规离心技术，更是需要具有尽可能快的加速和与之相应的减速，以缩短许多诸如培养细胞等温度敏感的样品在离心机中存留过长的时间。Eppendorf根据这方面应用的要求，开发并推出5702、5702R、5702RH系列离心机，已经成功地将离心机加速和减速时间缩短至25秒以内。 除了速度，另一个影响或评价临床与细胞实验室离心质量的指标是重混率。在这一方面的技术改进体现为以秒为级别的快速加减速同时兼顾柔和地保护样品，这项功能被称为“Soft”功能，特别适用于灵敏度要求很高的样品，如通过密度梯度离心法反复高效地分离细胞。从全血中分离单核细胞以及之后对它们分别进行分类是细胞学实验室常规的一项操作，这类细胞主要包括T细胞、B淋巴细胞和单核细胞。离心分离单核细胞，目前主要是通过利用由多聚糖Ficoll形成的密度梯度来实现的。红细胞的密度较高，因而离心后位于Ficoll层（密度1.077g/ml）之下形成血细胞沉淀，而且多聚糖与血细胞交联更加速了沉淀的过程。由于淋巴细胞、血小板与单

一、用51Cr铬酸钠标记靶细胞 短期标记法 1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。 2．如上用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。 3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。 二、4小时51Cr释放实验 1．在96孔圆底 细胞培养 板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。 2．向各孔加100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞的比例（效靶比，E：T）根据要求而定，通常为5：1～20：1。阴性对照孔（自然释放）不加效应细胞只加100μl完全培养液，阳性对照孔（最大

植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。 植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。1954年，植物单 细胞培养 才获得成功。Mllir 培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960年Jones等建立了微室培养法。同年，Cocking应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。 实验目的： 了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程 实验原理：

肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤 细胞培养 对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。 一、组织培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点： （－）形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 （二）生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌

1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞 株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。 2. 冷冻细胞解冻程序: 2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、 血清 种类和其它指定之成份和比例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之 血清 种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。 2.3. 将培养基置于37 °C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1

目的要求 1．掌握一般培养基制备的原则和要求。 2．熟悉一般培养基制备的过程。 操作步骤 一、培养基的制备原则和要求 培养基是根据各类微生物生长繁殖的需要，用人工方法把多种物质混合而成的营养物。一般用来分离、培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基和厌氧培养基。在制备培养基时，应掌握如下原则和要求： （一）培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质。所用的化学药品必须纯净，称取的份量务必准确。 （二）培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.2～7.6，呈弱碱性。 （三）培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。培养基经灭菌后，必须置37℃温箱中培养24小时，无菌生长者方可应用。 （四）所用器皿须洁净，忌用铁或钢质器皿，要求没有抑制细菌生长的物质存在。 （五）制成的培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生

　　采用这种方法的主要是Sysmex生产NE和SE系列血液分析仪，如SE-9000。此类 仪器 白细胞分类通过四个不同检测系统完成。 1.嗜酸性细胞检测系统 　　血液进入 仪器 后，经旋转阀准确分血2·4μl 加入0·6ml嗜酸性细胞计数的溶血剂，混合，由于 试剂 特殊的PH，使得除嗜酸性细胞以外的所有细胞溶解或萎缩，含有完整的嗜酸性粒细胞250μl液体通过小孔时，使计数电路产生脉冲而被计数。 2.嗜碱性细胞检测系统 　　计数原理同嗜酸性细胞相同，旋转阀准确分血4·8μl加入0·6ml嗜碱性 细胞计数 的溶血剂，由于此溶血剂只保留血液中的嗜碱性粒细胞，因此根据脉冲的多少可得嗜碱性细胞数量。上述二种方法除需要专用的溶血剂外，还需要特定的作用温度和时间。 3.淋巴、单核、粒细胞（嗜中性、嗜酸性、嗜碱性）检测系统 　　这个系统采用了电阻抗与射频联合检测的方法。这种方法用的溶血剂作用较轻，溶血剂穿透细胞膜仅使少量的胞浆

一、 常规操作 1. 穿着专用实验服。自己的白大衣或厚外套，可脱在门外的衣帽架上。 2. 穿着专用拖鞋。在缓冲间换下自己的鞋子，尽量避免在缓冲间走动、停留。 3. 细胞房最多可4个人同时使用。尽量避免在内长时间逗留、交谈。 二、 培养箱使用规则 1. 从培养箱取放物品前，用酒精清洁双手（或手套），尽量缩短开门时间和减少开门次数。 _培养箱中的空气是经过过滤的洁净空气。长时间敞开或频繁开关培养箱，容易造成污染。 2. 培养瓶皿放入培养箱前，用酒精消毒表面，并稍等至酒精挥发后再放入，以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。 3. 2-3人共用一层培养箱，按预定位置摆放培养器皿，方便查找，以免长时间敞开培养箱。 4. 普通培养中的细胞，若非实验需要，每瓶/板细胞每天只需要观察生长状态一次，2人以上共用的细胞，可约好时间一起观察。 _频繁将细胞拿出观察，容易给培养箱造成污染，同时也会影响细胞生长条件的恒定。 三、 显微

细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。细胞冷冻与复苏是 细胞培养 室的常规工作和通用技术。 第一节 细胞的冻存 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量

细胞是一切生物体最基本的结构单位和功能单位。细胞学研究在医学科学乃至生命科学中占有十分重要的地位。近代细胞生物学发展十分迅速，其研究方法逐步从传统的定性描述发展到定量的、细胞群体的研究，以获得更为客观的、具有统计学意义的测量数据，供进一步深入的研究。由此形成了一个新的领域，新的学科，即分析细胞学。流式细胞分析术(FCM)是分析细胞学最重要的组成部分。 分析细胞学也称为定量细胞学。它既是细胞生物学发展中的一个分支，又代表着细胞生物学发展过程中的一个重要阶段。分析细胞学是一个十分年轻的交叉学科，二十多年来发展十分迅速。它的发展是与近代其他一些科学技术的发展密切相关的，其中特别是激光技术、数字计算机技术、电子物理技术、电子摄像技术、光电测量技术、单克隆抗体技术及荧光细胞化学技术等等。 分析细胞学是从定量的角度对细胞的各种形态学参数、生物学特征、细胞生化成分的组成及含量以及细胞的各种功能等进行研究，将以往各种细胞学技术从定性、定位进一步发展到定量的研究，排除了各种主观因素的影响，获得定量的测量数据，更客观地揭示生命活动的规律。随着分析细胞学技术方法学的

人们曾以极大的努力来开展细胞移植以修复心脏和血管组织，但仍有许多问题尚待解答。还需要实验研究方面的进一步实验，需要仔细评估临床工作。本单元交流了这两方面的探讨。 （一）K Pinkornell报告从切下的皮下脂肪选择干细胞。细胞通过培养方法选择，可以在标准条件下生长。比较直接分离出来后的基线状态和培养30天之后的基因表达。基因表达分析集中于肌节（Sarcomeric）基因和与心脏有关的转录因子。分析表明TnT、Titin：MLC2a，MLC2v NKX2.5和GATA4等基因，在7天后已有表达。免疫细胞化学检查发现少数表达Titin和肌钙蛋白的细胞有些肌节组成。这些细胞转染了eGFP，注射入缺血再灌注猪模型。早期资料提示GFP（用抗体检查出来）和肌钙蛋白一同表达。资料是初步的，但在细胞移植后有保全心壁厚度的趋向。如果还没有十分的说服力的话，提示干细胞注射的有益效应，甚至可能有新心肌细胞形成。但从结果看是有前途的，需要进一步、更广泛的继续观察。 （二）N Werner（法）报告试图识别出对再内皮化最重要的细胞。从脾分离出单核细胞，根据 膜蛋白 CDIIb