一、 概念与意义 意义：能够有效地保持优良品种的特性； 生产无病毒种苗，防止品种退化； 快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用； 节约耕地，提高农产品的商品率； 便于运输。 目前受病毒危害严重影响生产的有： ·大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草。 ·蔬 菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。 ·果 树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。 ·花 卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等 块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年相当一部分产品要用留作种。如： 大 蒜：留种量占产量的五到八分之一。 马铃薯：留种量占产量的十分之一。 贝 母：留种量占产量的三分之一。 二、植物的脱毒技术 1．基本原理 病毒在植物体内的分布具有不均匀性 理论假说： (1)、能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供

一、 概念及意义 1．概念 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。 花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于 细胞培养 的范畴。 2．单倍体植物的特点 所谓单倍体(haploid)是指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。 diploid 植物其haploid即为monoploid 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 水稻 2n = 2x = 24 n = x = 12 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid植物其haploid为dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 陆地棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 26 hexaploid植物其

1植物组织培养 植物组织培养（Plant tissue culture）是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌 条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。 植物组织培养的理论基础是细胞全能性（cell totipotency），每一个活细胞都包含植物生长发育 所必需的全部基因，都具有再生成一个完全的有机体的潜力。 植物激素与植物分化有着密切的关系。生长素影响细胞壁的强度，促进细胞伸长和分裂，细胞分裂 素则促进细胞分裂并影响分化方向，二者的配比是影响脱分化和分化的关键。 植物组织培养再生植株过程是细胞再分化的过程，可以通过两条途径完成，一是器官发生途径，二 是体细胞胚发生途径。 植物的器官发生是指离体培养的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。 体细胞胚（Somatic embryo）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类 似物。体细胞胚发生途径是指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。体细胞胚起源于非合子细 胞，因此不同于合子胚。 2 人工种子

一、实验目的 通过对淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定，加深对酶和酶促反应的感性认识 二、实验原理 酶是微生物机体内生物合成的一种生物催化剂，它是高分子蛋白质，具有催化生物化学反应加速进行，并具有传递电子、原子和化学基团的作用。微生物的酶按它所在细胞的部位分为胞外酶、胞内酶及表面酶。本实验对胞外酶中的两种即淀粉酶和过氧化氢酶(亦叫接触酶)进行定性测定。 细菌淀粉酶能将遇碘呈蓝色的淀粉水解为遇碘不显色的糊精，并进一步转化为糖，淀粉被酶催化分解后用碘检测不到其变色现象；过氧化氢酶能将过氧化氢快速分解为水和氧气，能用肉眼很容易的观测到产生的气泡。 三、 仪器 和材料 1、 试管 (1 5 mm-1 50 mm)4支、 试管

一、实验目的 1了解并掌握培养基的配制、分装方法； 2掌握各种实验室灭菌方法及技术。 二、实验原理 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。 任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。 三、实验材料 1、器皿及材料 天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、

目的 ：学习利用细菌检测基因突变的方法 Ames试验 即鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验，是目前检测基因突变最常用方法之一。 原理 ：利用鼠伤寒沙门氏菌突变株，即组氨酸缺陷型，其原始菌株菌体内的组氨酸是通过自身一系列酶催化反应合成的，这种能自身合成所需营养成份的菌株叫做野生型菌株。本试验用鼠伤寒沙门氏菌为突变株，其不能合成组氨酸，而必须由外界提供这种菌珠被称为营养缺陷式营养实变型（his-）。当诱变剂作用于菌株后，在菌株遗传物质的特定位点发生基因回复突变成为野生型（his+），故在缺乏组氨酸的培养基上，只存少数自发回变菌落生长，而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌生长增多，从而可判断被药物是否具有致实变性。 材料 ：菌株，鼠伤寒沙门氏菌TA97，TA98，TA100，TA102。 器材 ：恒温培养箱，干燥箱，高压消毒锅，水溶锅，紫外线灯（15w），药物天平，分析天平 酒精灯，滤纸片，平皿，试管，烧杯，吸管。 培养基配制 1．Vogel-Bonner液10×（VB液

人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使细菌在体外环境迅速生长繁殖。细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、制备疫苗等 生物 制品都是必不可少的。 一、培养基的制备原则： 1、必须有充足的营养。 2、合适的酸碱度。 3、绝对无菌。 二、培养基的制备 培养基是用人工方法将多种营养物质按照各类微 生物 生长的需要而合成的一种混合营养料。 常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。 按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类。 以下介绍常用基础培养基的制备。 （一）肉汤培养基： 制法：称取营养肉汤粉1.8g（含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g）加入100ml蒸馏水中，用玻棒搅拌加热溶解。按需要分装于三角瓶或 试管 ，瓶口或管口塞棉塞，包装后置高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa（1.05公斤/厘米2）压力下

一、细菌的简单染色法 1 目的 1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。 1.2 掌握细菌的简单染色法。 1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 2 原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和

原理：采用沉降法，即通过于培养皿中利用自然沉降原理收集在空气中的 生物 粒子，经不少于48小时的培养，在30—35℃下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以菌落数来判定洁净环境内的活微 生物 数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。 主体内容： 1. 器材： 高压消毒锅：使用时严格按照说明书操作。 恒温培养箱：必须定期对培养箱的 温度计 进行检定。 培养皿：Φ90mm玻璃培养皿 培养基：营养 琼脂 2. 操作程序 2.1 采样 将已制备好的培养平皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖盖上后倒置。 2.2 培养： 2.2.1 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。 2.2.2 在30~35℃培养箱中培养，时间不少于48小时。 2.2.3 每批培养基应有对照实验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿做对照实验

一、实验目的 1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常 被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因： 1. 增加照明亮度 油镜的放大倍数可达 100 Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率 n

一、细菌的分布： 微 生物 种类繁多，繁殖迅速，分布广泛，不论自然界的空气、土壤、水，生活中的食物、各种物体和器械表面，以及动物和人的皮肤粘膜、与外界相通的腔道中都广泛存在着数量极其庞大的各种微 生物 ，其中以细菌、放线菌最多。因此，了解微生物在自然界及正常人体的分布，对于在医疗实践及某些科学实验中树立无菌观念有着重要的意义。 （一）空气中细菌的检查（设计性实验选题） （二）水中细菌的检查（设计性实验选题） （三）人体皮肤表面细菌的检查（设计性实验选题） 【附录】细菌菌落的计数方法 ①选择生长均匀，无片状菌苔生长的平皿观察。一般先用肉眼观察，用记号笔在平板底上进行点数（以免遗漏），然后再持放大镜检查有无遗漏的微小菌落。 ②如菌落多而密集，可用分区法或菌落计数器计数。分区法是用记号笔在平皿底部通过圆心做垂直线，分为 四区，再分别选择菌落密集和稀疏的两个区，再做平分线，使每一小区为平皿面积的1／8 或1／16，然后再分别挑选菌落稀疏和密集的两

一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微 生物 诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、 试管 、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力 搅拌器 、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择 可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。 2. 菌悬液制备 取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲

一、原理 菌落总数：指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN)表示。 人沙门氏菌病有四类综合症：沙门氏菌病；伤寒；非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，通常表现为轻度，持久性腹泻。伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过

细菌个体微小，普通光学显微镜下不易直接观察，故常用染色技术使细菌细胞着色。包括细菌单染技术、细菌的革兰氏染色技术、细菌的芽孢染色技术、细菌的荚膜染色技术和细菌的鞭毛染色技术 Ⅰ、细菌的单染技术 简单染色通常只用一种染色剂，使细菌整个细胞染上颜色。但看不清结构。所以只便于检查细菌的形态、大小和排列方式等。 【实验目的】 1、掌握单染色的操作技术 2、观察细菌的基本形态 【实验原理】 单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。 【实验材料、药品及器具】 1、菌种 大肠杆菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）

Ⅰ 细菌芽孢染色 某些细菌在其发育的一定阶段可以形成一个内生孢子，即为芽孢。芽孢形成后并不脱离原细菌菌体，它的形状、大小和在菌体的位置都是一定的。老熟的芽孢可自菌体中脱落出来。芽孢结构上的特点是壁厚和细胞质浓厚，所以不易着色，通常多采用着色力强的染色剂和用加热等手段促使芽孢着色，并利用复染的方法对比原细菌菌体和芽孢，才易于在显微镜下看到它们。但是，若用简单染色法使菌体着色而芽孢无色也可以衬托出芽孢的形状、大小和位置。 【实验目的】 掌握细菌芽孢染色的方法。 【实验原理】 细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透性差，不易着色，但是一旦着色又难以脱色。 通常，芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热的条件下进行。染色完毕，用蒸馏水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水冲洗掉，而进入芽孢的孔雀绿却难于溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染，使菌体和芽孢呈现不同颜色。 【实验材料、药品及器具】 1、菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）巨大芽孢杆菌（Bacil

一、设备和材料 恒温培养箱、恒温水浴槽、试管、移液管、菌落计数器、放大镜、托盘天平、称量纸、培养皿。 二、培养基和 试剂 营养琼脂培养基 0.9%生理盐水 三、检验程序 待检样 适当倍数的稀释液 选择2-3 个适当稀释度各1ml分别加入灭菌平皿内 每皿内加入适量营养琼脂 37℃ 48±2小时 菌落计数→报告 四、操作步骤 1．按无菌操作要求称取样品10g，连同100ml生理盐水加入灭菌三角瓶内，震荡，使成1∶10的均匀供试液。 2．用1ml 灭菌吸管吸取1∶10的供试液 1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，沿管壁注入装有9ml 灭菌的盐水管中，混匀即为1∶100的稀释液。 3．另取1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释。如此每递增稀释一次，应换用一支1ml灭菌吸管并充分混匀，稀释至10-3 倍数或适当倍数备检。 4．在做上述10倍递增稀释时，每稀释妥一稀释度，即可取1ml稀释液注入9厘米平皿内。（一般可根据对供试品污染情况的估计，从供试液起，选择2-

一、病毒感染后的形态学观察 （一）电镜观察病毒的形态 电子显微镜技术可直接观察病毒的大小、形态、结构以及病毒在细胞内增殖的动态过程。制作电镜标本的方法主要有超薄切片（厚度为100nm左右），磷钨酸负染法等。 通过观看病毒的电镜照片、幻灯片、多媒体，了解病毒（大肠杆菌噬菌体、流感病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病病毒等）的形态结构特点，以及它们与被感染细胞的关系。 （二）病毒包涵体的观察 某些受病毒感染的细胞内，可形成与正常细胞结构和着色不同的斑块，称为包涵体。应用光学显微镜检查包涵体，根据不同病毒包涵体的形态、染色、存在部位的差异，可辅助诊断某些病毒性疾病。 1、狂犬病毒包涵体（内基小体，Negri　body） 取狂犬海马部位神经组织病理切片，苏木精-伊红染色，置光镜下观察。 镜下特点：神经细胞染成蓝色，间质为粉红色，在神经细胞浆内可见一个或数个、圆形或椭圆形、染成红色的内基小体。注意包涵体形态、存在部位及染色特点。

实验目的：掌握培养基的配制原则与方法； 掌握划线分离纯化微生物的原理与方法 熟悉手提式高压灭菌器的使用方法和注意事项； 实验材料：器材：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅等。 试剂 ：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等 实验原理： 培养基是人工按一定比例配制的供微 生物 生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素、能源和水。根据微 生物 的种类和实验目的不同，培养基要选择合适的配比关系；选择合适的理化性质；配后要及时灭菌。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常

一、实验目的 1、学习分离和纯化菌株的方法； 2、学习营养口服液的制作方法及过程； 3、初步了解食品药品生产时的管理规定和技术标准。 二、实验原理 双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌等对人体有明显有营养保健作用，是微生态 试剂 的重要生产菌株。双歧杆菌是一种厌氧菌和微好氧菌株，它对生存环境的要求非常苛刻，易受氧、水分、光线、保护基质等条件的影响。微好氧菌株经过驯化，能承受一定氧压，既有利于生产，又能促进正常菌群生长和繁殖。在西红柿和豆粕煮汁中等中含有小分子蛋白、双歧杆菌生长因子和低聚糖等物质，能选择性增殖双歧杆菌。乳酸杆菌和乳酸球菌产酸快，从而为双歧杆菌提供较低的pH值环境，对它的生长繁殖有促进作用，因此选择乳酸杆菌和乳酸球菌作辅助发酵菌株。 与此同时双歧杆菌代谢后会产生醋酸及乳酸，使培养液呈酸性，虽能抑制有害菌的生殖，但如果pH值过分降低也使菌体其自身受到酸性的影响

一、基本知识与原理 转导是以噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。随着分子遗传学的发展，转身已成为基因精细结构分析的常用方法之一。 根据噬菌体转导供体菌基因的差异，转导可分为普遍性转导和局限性转导。这里以局限性转导为例说明转导的基本原理。局限性转导实验中常用的是大噬菌体，它能整合在大肠杆菌染色体DNA上的半乳糖基因（gAl）和生物素基因（bib）之间，因此，它能转导半乳糖基因（一）又能转导生物素基因（bio）。 本实验选用大肠杆菌 E。oh K．2（A）为供体菌（即大噬菌体的DNA已整合在大肠杆菌的DNA上，我们称该大肠杆菌为溶源性大肠杆菌，’gAT””为带有半乳糖基因）。由于在此供体菌中噬菌体与半乳糖基因（匆”）紧密连锁，因此，当此供体菌受紫外线照射后会产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有半乳糖基因的转导噬菌体。当这种转导噬菌体与受体菌 ECo］i K；。 s gAl－（此细菌不能利用半乳糖，‘’表示此细菌半乳糖基因发生突变）混合接触时，带有一基因的转导噬菌体能以一定的频率整合到受体首上，从而使不能利用半乳糖的 g