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双酶切连接反应的经验谈

1、 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近,必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的,则必须先切,否则就可能造成酶切失败。 2、 回收PCR产物:回收的PCR产物片段=1:10 ,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA:(X pmoles×长度bp×650)/ 1,000,000 (注:长度bp×650是该双链DNA的分子量)所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp,则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。 3、 双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要,一般酶切3个小时,对于PCR产物,可以过夜酶切,效果会很好。酶切体系不宜过大,会影响质粒和酶的碰撞机会,效果降低;质粒量不应该超过

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聚合酶链式反应(PCR)扩增

材料、设备及试剂   一、材料   不同来源的模板DNA。   二、设备   移液器及吸头,硅烷化的PCR小管,DNA扩增仪(PE公司),台式高速离心机。   三、试剂:   1、10×PCR反应缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris?Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100。   2、MgCl2 :25mmol/L。   3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。   4、Taq DNA聚合酶5U/μl。    操作步骤   一、PCR反应   1. 依次混匀下列试剂    35μl H2 O    5μl 10×PCR反应缓冲液    4μl 25mmol/L MgCl2    4μl 4种dNTP  

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双酶切的一点心得

1、双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时,可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表,如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话,就可以用这种buffer作为反应buffer,如在TaKaRa公司的目录,就提供了很好的Buffer参照表,比如Sac Ⅱ和Hind Ⅲ就没有通用Buffer,但是,可以用T+BSA来酶切,而且效率还可以;如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份,相似的话可以考虑各取一半中和;任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积,而且最大反应体系最好不要小于20 ul。 2、如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活,如CIAP;有的则不行。 3、第一次酶切后通过电泳确证酶切

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四步法消除SYBR Green Ⅰ实时定量RT2PCR中引物二聚体

张驰宇1 ,2) ,  张高红1 ,2) ,  杨 敏1) ,  贲昆龙1) 3 (1) 中国科学院昆明动物研究所分子与细胞免疫学实验室,昆明 650223 ;2) 中国科学院研究生院,北京 100039) 摘要 为建立一种新的SYBR green Ⅰ实时定量RT-PCR 方法,使之能够有效消除引物二聚体(PDs)对实时定量结果的影响. 对RT-PCR 特异性扩增产物和PDs 分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析. 依据PDs 和扩增产物的熔解温度( Tm) 特点,在通用的三步法的延伸步骤之后,增加一个短暂的(5 s) 恒温和荧光检测步骤,使这个步骤的温度高于PDs 的Tm ,但低于扩增产物的Tm ,简称该法为四步法. PDs 的Tm 通常高于72 ℃,但低于扩增产物的Tm . 将四步法第四步的温度设置在高于PDs 的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时,四步法能够有效地消除PDs 的影响. 对三步法和四步法SYBR green Ⅰ实时定量RT-PCR 进行了比较,发现三步法根本不能用于RNA

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一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建

一种新颖简便的荧光实时 RT-PCR相对定量方法的建立 A Novel and Convenient Relative Quantitative Method of Fluorescence Real Time RT-PCR Assay Based on Slope of Standard Curve 稿件编号:2005-0257 中文关键词:荧光实时定量 RT-PCR ,相对定量,绝对定量,标准曲线, mRNA 定量,斜率 英文关键词:fluorescence real-time quantitative RT-PCR, relative quantification, absolute quantification, standard curve, mRNA quantification, slope 基金项目:江苏省高校自然科学指导计划资助项目(04KJD180044)和江苏大学高级人才科研启动基金资助项目(228127000

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免疫PCR要点与注意事项

一、免疫PCR要点 (1)连接分子 免疫PCR需要适当的连接分子连接报告分子和抗原抗体复合物。1 992年Sano用重组的链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子,创立了免疫PCR技术。该融合蛋白的蛋白A可结合抗体的Fc段,链亲和素可结合DNA分子上的生物素,Sano利用此连接分子把一段生物素化的DNA(PUC19质粒DNA)连接到固定在酶标板上的抗原抗体复合物上,成功的检测到了牛血清蛋白,比传统ELISA法的敏感生105倍。 1993年,Ruzicha用生物素化单抗-亲和素-生物素化DNA分子复合体代替链亲和素-蛋白A嵌合体连接的单抗DNA复合体。Zhou等人发现链亲和素(streptavidin)不含糖基,做连接分子特异性优于亲和素(avidin);Marian进一步指出中性链亲和素(neutravidin)特异性比链亲和素更佳,因为前者是一种经过特殊修饰了的亲和素,大大降低了非特异性吸附的可能。此后链亲和素(亲和素)系统被广泛应用,二

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RT中Olig(dT)15引物与随机引物?

RT实验Olig(dT)15引物合成的条带明显优于随机引物,不是随机引物的效果较好吗?怎样解释这种现象 网友一回答: Olig(dT)适合于长链甚至全长mRNA的RT,要求RNA必须有Poly A,所以真核生物的mRNA都适用,对RNA样品的质量要求较高,最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。 随机引物 适合各种RNA的RT,尤其适合短链mRNA和模板丰度很低的情况(比如某个gene表达量很低)。一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng,如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng,可能会导致小片段产物(<500bp)的增加和长片断、全长产物的降低。 总的来说,二者各有利弊。最好做预实验时就试验一次,选择最佳的引物。 网友二回答 Olig(dT)适合于长链甚至全长mRNA的RT,要求RNA必须有Poly A,所以真核生物的mRNA都适用,对RNA

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PCR之引物详解

1. 引物是如何合成的?   目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。 DNA 合成仪有很多种 , 主要都是由 ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。   亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的,合成的方向是由待合成引物的 3' 端向 5' 端合成的,相邻的核苷酸通过 3'→5' 磷酸二酯键连接。   第一步是将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其 5'- 羟基的保护基团 DMT ,获得游离的 5'- 羟基;   第二步,合成 DNA 的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的 3' 端被活化, 5'- 羟基仍然被 DMT 保护,与溶液中游离的 5'- 羟基发生缩

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Real time PCR 实验注意事项

实验中的一些好习惯 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均 移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性 一定要记着关水浴箱,切记切记 多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了 所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。 3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然

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简并引物设计方法

一 利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码子的关系,不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的,所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统,查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白),在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。 二、对所找到的序列进行多序列比对 将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对,可选工具有Clustal W,也可在线分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其结果所示,所有序列的共有部分将会显示出来。“”表示保守,“:”表示次保守。 三、确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域,且两个保守区域相距50~ 400个aa为宜,使得pcr产物在150~1200bp之间,最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基,因为每条

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PCR引物设计知识与技巧分析

自从1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(PCP) 以来,PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。然而能否找到一对合适的核苷酸片段作为引物,使其有效地扩增模板DNA序列,无疑决定着PCR的成败。现在动物遗传育种早已进入了分子时代,在基因水平寻求影响动物遗传表型的新基因突显重要,因此引物设计无疑又成为了寻找新基因的重中之重。 1 引物的设计以及初步筛选 引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的, 目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物,再用软件Oligo 6进行引物评估,就可以初步获得一组比较满意的引物。 但是对于初学者来说,运用软件和程序来设计引物好象无从着手,其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项,所有问题便迎刃而解。

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详细介绍引物设计原则

引物设计原则一: 1. 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的T

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PCR实验污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。一、污染原因1、标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。2、PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3、PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。4、实验室中克隆质粒的污

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关于进化树分析及其相关软件的使用和应用范围

关于进化树分析及其相关软件的使用和应用范围 来源:易生物实验 浏览次数:0 网友评论 0 条 进化树也称种系树,英文名叫“Phyligenetic tree”。对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤:⑴ 要对所分析的多序列目标进行排列(To align sequences)。做ALIGNMENT的软件很多,最经常使用的有CLUSTALX和CL 关键词:进化树分析 进化树也称种系树,英文名叫“Phyligenetic tree”。对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤:⑴ 要对所分析的多序列目标进行排列(To align sequences)。做ALIGNMENT的软件很多,最经常使用的有CLUSTALX和CLUSTALW,前者是在WINDOW下的而后者是在DOS 下的。⑵ 要构建一个进化树(To reconstrut phyligenetic tree)。构建进化

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蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3中文使用说明

蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3中文使用说明 来源:易生物实验 浏览次数:0 网友评论 0 条 蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3是位于法国的蛋白质生物与化学研究院(Institute of Biology and Chemistry of Proteins)用十多年时间开发出的蛋白质研究软件包。软件包包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容 关键词: 蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3是位于法国的蛋白质生物与化学研究院(Institute of Biology and Chemistry of Proteins)用十多年时间开发出的蛋白质研究软件包。软件包包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容,功能非常强大。应用此软件包,使用个人电脑, 便能进行各种蛋白序列分析与特性预测。感谢软件的编写者,他们将此软件包免费提供给此领域的同行使用,这对

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DD-RT-PCR定义是什么?

传统mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾(polyA)结构,因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征,设计合成了12种下游引物,称3′-锚定引物,其通式为5'-T11MN;同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列,在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带,其中每一条都代表一种特定mRNA种,这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回收,扩增至所需含量,进行Southernblot或Northernblot或直接测序,从而对差异条带鉴定分析,以便最终获得差异表达的目的基因。 虽然mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)具有很多优点:1)速度快,较易操作;2)由于PCR

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卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知

卫法监发[2002]51号 各省、自治区、直辖市卫生厅局、卫生部卫生监督中心: 为进一步规范保健食品原料管理,根据《中华人民共和国食品卫生法》,现印发《既是食品又是药品的物品名单》、《可用于保健食品的物品名单》和《保健食品禁用物品名单》(见附件),并规定如下: 一、申报保健食品中涉及的物品(或原料)是我国新研制、新发现、新引进的无食用习惯或仅在个别地区有食用习惯的,按照《新资源食品卫生管理办法》的有关规定执行。 二、申报保健食品中涉及食品添加剂的,按照《食品添加剂卫生管理办法》的有关规定执行。 三、申报保健食品中涉及真菌、益生菌等物品(或原料)的,按照我部印发的《卫生部关于印发真菌类和益生菌类保健食品评审规定的通知》(卫法监发[2001]84号)执行。 四、申报保健食品中涉及国家保护动植物等物品(或原料)的,按照我部印发的《卫生部关于限制以野生动植物及其产品为原料生产保健食品的通知》(卫法监发[2001]160号)、《卫生部关于限制以甘草、麻黄草、苁蓉和雪莲

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食品安全法学习

2009年2月28日第十一届全国人民代表大会常务委员会第七次会议高票通过中华人民共和国食品安全法(其中158票赞成、3票反对、4票弃权获高票通过,反对主要针对分段监管的模式)。从09年6月1日起施行。最近通过参加单位组织的培训、自己看书、网上看评论文章等的学习,在综合各种资料和信息基础上,也谈谈食品安全法。 一、食品安全法的立法背景 一是食品安全事件时有发生。从苏丹红、阜阳的大头娃娃和最近的三鹿奶粉事件。还有食物中毒等事件。二是处罚较轻,执法成本高。因为之前的食品卫生法是1995年颁发的,随着社会和经济的发展,处罚的力度跟不上目前的发展需要。以前的处罚:有违法所得,没收违法所得,并一般处以违法所得五倍以下的罚款,不会超过5倍;没有违法所得的,最高处五万元的罚款。三是未明确食品生产经营企业和经营者的责任。只是通过监管手段来规范其合法生产经营。 二、食品安全法的立法思路 以建立统一、公正、高效的检验检测体系为基础,规范食品生产、经营、餐饮企业的行为,严格其在食品卫生安全方面的法律责任;建立科学运转、高效便民、责任明

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化妆品违禁成分、限用物质

眼部用化妆品、婴儿用化妆品:微生物、重金属 微生物:一是细菌总数指标,如我国规定在眼部、口唇、口腔粘膜用化妆品以及婴儿和儿童用化妆品细菌总数不得大于500个/ml或500个/8,其他化妆品细菌总数不得大于1000个/mi或1000个屯。二是化妆品中不得含有致病菌。即不得检出特定微生物,各国规定不一样,我国规定的特定菌是3种:绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和粪大肠菌群。 防晒类化妆品:PH值、紫外吸收剂 PH值:测定pH可以评价和核对企业的产品质量及监督市售产品的质量变化和安全性。特别是用于皮肤和毛发的化妆品。人体皮肤大体上可分为表皮、真皮和皮下组织三部分。表皮的最外层是角质层,由鳞片状扁平的角细胞组成。其质地坚韧而有弹性,主要起保护作用,还具有防酸和防紫外线辐射等作用。角质层的成分是角蛋白,呈弱酸性(pH5.5~6.2),其吸水性强,与酸碱结合后容易变质。因此,人体用的化妆品和洗涤剂的pH应接近7,或者和皮肤的pH相等,以减少角质层的化学变质。角质易溶于稀碱溶液中。化妆品的pH过酸或过碱性,不仅影响化妆品功效的正常发挥,还可造成刺激性皮炎

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莱顿低温实验室

  19世纪末20世纪初始,曾在低温实验的研究方面开展过一场世界性的角逐,在这场轰动的科坛竞赛中,处于领先地位的是位于荷兰一座小城的莱顿低温实验室。   谈到莱顿低温实验室就不得不先提及它的创始人,低温物理学家卡麦林·昂尼斯(Kamerlingh Onnes ),他于1853年9月21日生于荷兰的格罗宁根,1926年2月21日卒于荷兰的莱顿。因制成液氦和发现超导现象于1913年获诺贝尔物理学奖。   1882年,29岁的昂尼斯被任命为莱顿大学物理学教授和物理实验室负责人。当时物理学正处在一个转变的时代,人们越来越重视物理实验。昂尼斯在担任莱顿大学物理实验室负责人后,就决定把研究低温物理作为主攻方向。要进行低温方面的实验,首先就要获得低温,低温要靠液化气体获得,当时只有氢和氦还没有被液化。英国物理学家杜瓦从1877年开始研究,经过二十多年,于1898年液化了氢。昂尼斯领导的莱顿大学物理实验室为了满足低温研究的需要,于1892~1894年建成了大型的液化氧、氮和空气的工厂,1906年可以大量生产液氢,为液化氦打下了坚实的基础。又经过两年奋斗,终于在1908年7月10日成功

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