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引领PCR仪创新革命的ABI Veriti

相关专题 ABI作为PCR仪 中最值得信赖的品牌,引领了PCR仪一系列创新性设计革命。Veriti系出名门,秉承了一贯的可靠性,并是真正意义上的梯度多重控温(六合一)梯度PCR仪。 温度梯度PCR仪 进展 温度梯度PCR仪最先由eppendorf 公司在1998年研发成功推向市场(Mastercycler Gradient),此后Biometra、MJR、Bio-rad、Thermo等公司相继推出各种型号的温度梯度PCR仪,所采用的技术相差无几。那究竟什么是温度梯度PCR仪呢?可以把一次PCR扩增实验设置成一系列不同的退火温度条件(温度梯度)的实验,这样的仪器就叫梯度PCR仪。设置梯度的主要原因是因为被扩增的不同DNA片段,其最适退火温度不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR反应就可以筛选出表达量最高的最适退火温度,优化实验,进行有效的扩增。梯度PCR仪主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,在节约成本的同时也节约了时间。梯度PCR仪在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增,可以说是一台多功能的P

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寡核苷酸实验经典问题和回答

相关专题 在不少生命科学重点实验中,我们都需用到寡核苷酸 ,因此,掌握寡核苷酸的技术对于整个实验非常重要。本文集合了各个论坛里的兄弟姐妹对寡核苷酸相关实验和概念的经典问题和回答,希望对大家的实验有所启发。 Q1、大家好,最近看文献,发现了反义寡核苷酸 、义寡核苷酸、错义寡核苷酸(无意义寡核苷酸),我知道反义寡核苷酸技术,但是什么叫义寡核苷酸、错义寡核苷酸(无意义寡核苷酸),查了一下没有搞清楚,请各位老师帮忙解释一下啊,非常感谢! A1、举个例子说明吧。 Stat3正义寡核苷酸 序列:5’ AGAAACAGGATGGCCCAATGG 3’,即与原始DNA序列的正链; Stat3反义寡核苷酸 序列:5’ CCATTGGGCCATCCTGTTTCT 3’;即正链的反向互补序列; Stat3错义寡核苷酸 序列:5’ CCATTGCGCCATCGTGTTACT 3’;即将反义链个别或若干个碱基随机改变,产生的新链,又叫scrambled strand. Q2、在非变性的聚丙烯酰胺凝胶中,相同长

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2012年PCR技术盘点:目标更小 通量更高

相关专题 明年是聚合酶链式反应PCR 技术诞生的三十周年,这项技术为生物学,医学研究领域带来了革新性的变化,被广泛的用于传染病诊断,基因复制,遗传疾病鉴定等等方面。 经过多年的发展,PCR 技术越来越完备,虽然其基本程序:变性,退火,延伸并没有发生太大的改变,但是科学家们和技术人员改进了这一方法,也研发出了许多新品种PCR方法,解答了许多此前难以回答的生物学问题。从热稳定的聚合酶,到自动热循环的程序,新的数字PCR(dPCR)方法,再到可应用于高通量PCR的相关微流体设备,没有人认为PCR是一种静态的方法。 许多PCR步骤逐渐被改进,如试剂优化,引物设计优化,产量提高,扩增片段延长,保真度提高,多重反应,定量PCR的发展,这些方面的技术进步极大的拓宽了我们选择性扩增DNA的能力,为许多下游应用提供了更为精确的产物。今天,PCR广泛应用于生态,取证和食品安全 等领域,同时也是分子生物学研究基础实验的重要组成元素。 那么在未来一年里,PCR 技术又会出现哪些方面的进步呢? 目标更小 随着生物学家们

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罗氏推出最新款实时荧光PCR仪LightCycler® 96

相关专题 2012年底,罗氏诊断新推出一款实时荧光定量PCR仪 --LightCycler® 96,这款系统的出现丰富并完善了罗氏生命科学领域的LightCycler®实时定量PCR家族产品线。该系统集多重优秀性能为一体,现今已同步在中国上市,并且将在罗氏诊断应用科学部2013年的3-4月的全国巡回技术研讨会上隆重亮相,届时罗氏相关的产品专家将为您分析这款仪器的性能和价值。 无论是基因变异还是基因表达领域,抑或是大多其他领域的研究人员,都可以使用LightCycler® 96快速地获得高准确度、重复性高的可靠数据,并且可以满足各种特殊的实验导入和导出需求。无论您是初出茅庐的qPCR新手,还是久经沙场的实验达人,LightCycler® 96简单易懂的友好界面都可以让您一目了然,无师自通。对于初次使用的用户来说,常规的基因表达和遗传变异研究实验设置都变得易如反掌;对于qPCR实验操作熟练的用户,分析软件 能直接输出经过严谨计算分析、符合国际文章发布要求的数据结果。 LightCycler® 2.0 卡盘式实时荧光定量PCR

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DIG标记的Northern杂交试验指导

相关专题 Northern Blotting技术专题 一、 RNA提取 方法一、改良异硫氰酸胍提取法 试剂及其配制 异硫氰酸胍变性液: 贮存液-在含484ml 水(经DEPC处理), 17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g异硫氰酸胍,加热至60~65℃并持续搅拌使之充分溶解。贮存液室温保存备用(不超过3个月)。 工作液-在每50ml贮存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室温下保存不超过1个月。工作液各成分的终浓度为: 4mol/L异硫氰酸胍 25mol/L柠檬酸钠pH 7.0 0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl) 0.1mol/L巯基乙醇(2-ME) 其它溶液: 2mol/L乙酸钠 (NaAc) 缓冲液 (pH 4.0) 水饱和酚(pH 3.5) 49∶1 (v/v) 氯仿/异戊醇 100%异丙醇 70%乙醇(用D

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组织印迹的Northern杂交实验步骤

相关专题 Northern Blotting技术专题 1)硝酸纤维素膜或尼龙膜上的组织印迹 1.在塑料板上放置两层Whatman 1号滤纸,在滤纸上方放上一张普通纸,然后铺上一层尼龙膜。 2.用双面刀片从植物 组织如大豆的茎上切取一块切片(厚度约为1mm)。如果组织表面是湿的,则在Kimwipes纸上轻轻吸干或先用蒸馏水洗涤几秒钟然后再用Kimwipes纸吸干。用镊子将组织切片转移到硝酸纤维素膜上,注意一旦将切片放置在膜上就不得再移动切片。在切片上放置4层Kimwipes纸,用手指轻压15~20秒,用镊子小心拿开纸和组织切片。组织切片经甲苯酸蓝染色后观察其解剖结果。 3.80℃真空烘烤留有组织印迹的尼龙膜2小时或用UV cross-linker在紫外光下照射尼龙膜。 4.将留有印迹的膜面向下,放入载玻片上的一滴甲苯酸蓝溶液中,对组织切片进行染色。2~3分钟后,吸干多余的染料,用间接照明立刻照相。将载玻片翻转,透过玻璃拍摄被染色的组织切片。在切片上粘上几张纸片以免组织切片接触显微镜。 2)用35S-标记的RNA探针检测植

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核酸序列分析的内容和步骤案例分析

相关专题 原理 针对核酸序列的分析就是在核酸序列中寻找基因,找出基因的位置和功能位点的位置,以及标记已知的序列模式等过程。在此过程中,确认一段DNA序列是一个基因需要有多个证据的支持。一般而言,在重复片段频繁出现的区域里,基因编码区和调控区不太可能出现;如果某段DNA片段的假想产物与某个已知的蛋白质或其它基因的产物具有较高序列相似性的话,那么这个DNA片段就非常可能属于外显子片段;在一段DNA序列上出现统计上的规律性,即所谓的“密码子偏好性”,也是说明这段DNA是蛋白质编码区的有力证据;其它的证据包括与“模板”序列的模式相匹配、简单序列模式如TATA Box等相匹配等。一般而言,确定基因的位置和结构需要多个方法综合运用,而且需要遵循一定的规则:对于真核生物序列,在进行预测之前先要进行重复序列分析,把重复序列标记出来并除去;选用预测程序时要注意程序的物种 特异性;要弄清程序适用的是基因组序列还是cDNA序列;很多程序对序列长度也有要求,有的程序只适用于长序列,而对EST这类残缺的序列则不适用。 1. 重复序列分析 对

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三种荧光定量PCR试剂对比

相关专题 北京百泰克—国内自主研发核酸提取与PCR相关试剂盒商家 PCR实验室产品选择指南 为检验BioTeke公司实时荧光定量试剂(SYBR GreenⅠ)质量,本次实验分别采用国际知名的ABI公司(ABI Power SYBR Green PCR Master Mix)、TOYOBO公司(Realtime SYBR GreenⅠPCR Master Mix)和BioTeke公司产品进行实时荧光定量PCR分析,实验过程中除了荧光定量试剂Mix不同,其它反应条件(模板、引物和反应体系等)均一致,所用荧光定量PCR仪 型号为ABI7000。 实验材料 小鼠肝脏组织 实验方法 RNA提取 :RNApure高纯总RNA提取试剂盒(BioTeke),操作步骤参照说明书。目的基因:小鼠管家基因β–actin.。 cDNA制备:测定小鼠肝脏总RNA浓度,而后使用Super RT Kit(BioTeke) 制备20μl cDNA。操作参照试剂盒说明书。 二步法荧光定量PCR : 小鼠肝脏组织RNA

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PCR引物设计原则之个人经验

相关专题PCR实验室产品选择指南记得当初写本科论文,感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。后来PCR成为实验最基本的一步了,但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。PCR的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多,在大多数情况下,我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库 的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标间取得平衡:扩增特异性和扩增效率。引物分析软件 将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理:① 引物长度一般引物长度为18~30碱基。总的说来,决定引物退火温度 (Tm值)最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。在引物长度小于20bp时:[4(G+C)+2(A+T)]-5℃在引物长度大于20bp时:62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃另外有许多软件 也可以对退火温度进行计算,其计算原理会各

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耐热DNA聚合酶常见问题(Thermpholic Polymerases FAQ)

相关专题 PCR实验室产品选择指南 NEB公司研发的VentR和Deep VentR DNA聚合酶都是克隆于海底高温喷泉的微生物,其耐热性能和保真性能远高于Taq DNA聚合酶。VentR的半衰期在100°C时是1.8小时,是Taq DNA聚合酶的18倍,而Deep VentR则对高温的耐受性更强,半衰期是8小时。两者的保真性能是Taq DNA聚合酶的5-15倍。由于具有3'→5'的外切酶活性,可去除错配的碱基,从而使延伸反应顺利地进行下去,因此,更适用于long PCR 反应。 在不断寻找新酶的基础上,NEB还致力于对原有酶的修饰和改造,VentR(exo-)和 Deep VentR(exo-) DNA聚合酶就是在原有酶的基础上,去除其3'→5'的外切酶活性,使其更适用于双脱氧法测序 和高效率的PCR。虽然保真性能比VentR和Deep VentR有所降低,但仍是Taq DNA聚合酶的2倍。 如何应用DNA聚合酶合成4-15 kb的PCR 产物? 使用正确的酶量。使用具有校读功能的VentR DNA聚合酶 时,

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质粒提取过程中常见的问题及参考见解

相关专题 质粒提取经常因操作不当引起提取的质粒不纯,或遇到各种问题,本文归纳了几个质粒提取过程中常见的问题及参考见解供大家参考。 质粒提取过程中常见的问题及参考见解 1、涂布棒在酒精蘸一下,然后烧一下,能不能保证把所用的菌烧死? 参考见解:涂布棒可以在酒精中保藏,但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会,烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后,冷却了再涂。同时作多个转化时,应用几个涂布棒免得交叉污染。 2、原先测序鉴定没有问题的细菌,37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解:这种情况出现的几率较小,常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法: (1)、 降低培养温度,在20~25℃下培养,或室温培养可明显减少发生概率。 (2)、 使用一些特殊菌株,如Sure菌株,它缺失了一些重组酶,如rec类等,使得质粒复制更加稳定。 (3)、 质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的,请大家注意一下! 3、未提出质粒或质粒得率

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RNA提取:CTAB-PVP法的改进

相关专题 本文讲述了用CTAB-PVP法提取RNA的几点方法的改进,可提高提取得到更完整和纯度更高的RNA产物。 RNA CTAB是一种强变性剂,变性效果优于SDS,能够有效除去蛋白(含复合蛋白)等杂质。此外,与常规的CTAB法比较,本方法还有如下改进: 1) 在提取液中加入较高质量浓度的PVP。这不仅能有效地去除棉花组织中的酚类物质和多糖,还能去除一些其他色素物质和脂类,提高RNA的完整性和纯度。 2) 在提取液中加入β-巯基乙醇。棉花中含有大量的酚类物质,在细胞破碎时其自动氧化而与RNA不可逆地结合,从而影响RNA的产率和纯度,这也是棉花RNA难以提取的重要原因。在提取液中加入β-巯基乙醇,这不仅避免了酚类物质的氧化,还提高了RNA的产率和纯度。 3) 在用苯酚:氯仿抽提时,使用低pH的苯酚( pH 4.0 )。苯酚在低pH的情况下能促进水相中的蛋白和DNA向有机相分配,从而最大限度的除去总RNA中的蛋白和DNA。 4) 用LiCl选择性的沉淀RNA。这可以充分除去RNA中的D

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核酸分离纯化的材料与方法的选择

相关专题 本文给大家详细讲述了核酸分离与纯化过程中材料与方法的选择与其原则,不同的方法可以达到不同的要求,方法的选择会对核酸的产量及完整性等有不同的影响。 核酸分离纯化的材料与方法的选择 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子,均与蛋白质结合成核蛋白(nucleoprotein)。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白(deoxyribonucleoprotein,DNP),RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内,约占95%,为双链线性分子;后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内,约占5%,为双链环状分子。除此之外,在原核生物中还有双链环状的质粒DNA;在非细胞型的病毒颗粒内,DNA的存在形式多种多样,有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大,一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3.0×109个碱基对(base pair, bp)组成,与5 243bp的猿猴

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肺癌树突状融合细胞的制备及其生物学特征

摘要: 探讨利用杂交瘤技术制备肿瘤疫苗的方法,研究肺癌树突状融合细胞的生物学特征. 摘 要: 目的 探讨利用杂交瘤技术制备 肿瘤 疫苗 的方法,研究 肺癌 树突状融合细胞的生物学特征.方法  用PEG法将HGPRT缺陷型Lewis肺 癌细胞 株AL9901与小鼠 骨髓 诱生的树突状细胞进行融合,HAT筛选融合克隆;S-P 免疫细胞 化学法鉴定融合细胞表型;对融合细胞进行生长曲线、 克隆 形成和体内成瘤等鉴定.结果 树突状细胞与AL9901以6∶1比例融合,融合率约为30%.融合细胞FLD-A11可在体外传代培养,表型为CD80+、CD40+、H-2Kb+、MIDC+和肺癌抗原阳性.FLD-A11不能在软琼脂培养基中形成克隆,动物体内不能形成肿瘤.结论 利用杂交瘤技术制备的FLD-A11细胞,具备了在体内激活抗特异性地抗

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RNA生物信息

1.RNA Ontology Consortium简介 RNA本体联盟(RNA Ontology Consortium,ROC) 是用来搭建一个整合的概念架构-RNA本体( Ontology,RO)-用它来理解RNA在生物学上的功能,用它进行RNA生物学、化学以及基因组学前沿研究。确切的目标就是创建一套有关RNA兼容的结构、具有动态形式的控制字汇和分类系统,这些都是以RNA序列、次级结构以及三维结构为基础。它们的中心目标就是鉴定所有RNA的特征,相互作用,以及在一些数据库和文献中提及存储的RNA基序(motif),给予他们定义,用一种结构性的方式来进行书面的定义。这些都是非常及时有用的

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做实验需要注意的五大细节

话说细节决定成败,各位童鞋应该深有感触,希望各位都能够说说你们的感想! 实验的成功率很重要,而要提高成功率,就必须注意细节。以下是做实验需要注意的五大细节: 一、记录 人的记忆力是有限的,在做实验的时候,不可能记住做过的每一步。例如实验记录如果不及时写,第二天就会忘记很多,一周之后就完全忘记了。所以做实验 一定要做好实验记录。记录一要及时,否则就会忘记,最好是随时记录。二要详细,因为一个很小的细节可能就是实验失败或者成功的原因,如果没有记下这个细 节,实验出问题了就难以找到原因。例如,做实验用的试剂是哪一瓶,什么时候配的(尤其是容易失效的试剂),如果是用PBST配的5%BSA,加了 0.02%的Sodium Azide抑制微生物生长,就应该记录为5%BSA.PBST.N3Na,而不是5%BSA。三要整洁,如果过于潦草,看起来很不方便,需要找相关信息的 时候就难以找到。配好的试剂做好标签也是一种记录,标签一定要详细:包括试剂名称、配置日期、配置者及其它必要信息。在配试剂的时候,为了防止忘记贴标签 的情况,应该先贴标签,再加试剂。电子记录

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非放射EMSA实验技术讨论

EMSA是一个比较复杂的试验技术,由于工作原因接触这个试验技术到现在也有三年多的时间了,做了大概也有几百次吧, 那倒理想的试验结果的同时也碰到了很多莫名的问题和结果,到现在为止还有没有解决的,找不到原因的一个问题,呵呵! 现和smalldonkey商量一下将我对这个实验技术的总结和一个心得写出来给大家分享,批评指正。EMSA实验技术作为一个经典的DNA/protein,RNA/protein的检测技术,不是很多简单的实验技术可以替代的! 比如曾经在我们这个论坛中有站友提到这样一个问题: 某公司的激活-和转运检测试剂盒,监测是否激活NF-KB测试剂盒原理:NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物,分布在细胞浆中。在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活NF-κB的刺激存在的情况下,IκB-α会在Ser32和Ser36被磷酸化,随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-κB和IκB-α解聚后,其核定位序列被暴露,从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。通过免疫染色检测NF-κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内,就可以判断NF-κB是否被激活.本NF-κB激活-核

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绞股蓝提取物中绞股蓝总皂甙(Gypenosides)

绞股蓝提取物中绞股蓝总皂甙(Gypenosides) 含量的测定方法 一、仪器及试剂中国植物提取物论坛/c!S2T3_!}8U 甲醇(AR) 人参皂甙Rb1对照品 1%香草醛高氯酸溶液:称取1g香草醛于100mL容量瓶中,用高氯酸溶解定容。中国植物提取物论坛-t-L-W-?7F/p R8E:M!N 硫酸溶液:23mL水和77mL浓硫酸混匀即可。3|-G4@!Z a-k2} 二、测定方法 1.标准曲线绘制 准确称取5mg人参皂甙Rb1对照品于25mL容量瓶中,加甲醇溶解,定容。精密吸取该溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别于10mL的具塞试管中,用热风吹干,精密加入新配制的1%香草醛高氯酸溶液0.5mL,混匀于60℃水浴中加热15min后取出,立即放入10℃以下的水中冷却2min,然后加入硫酸溶液5mL,摇匀,放置,待气泡消失后,以试剂同样操作做空白,在550nm波长处,以吸收值为纵坐标,以浓

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各类烟草色素对烟叶品质的影响

  各种烟草色素的含量和性质不仅直接影响烟叶的外观质量,而且还直接和间接地影响烟叶的内在品质。各类烟草色素的含量与烟草生长发育过程代谢积累特性和调制方法密切相关。不同类型的烟草具有不同的色调,即使相同类型的烟草,烟叶色调也存在差异。调制后烤烟烟叶颜色多为橘黄或柠檬黄;白肋烟和香料烟烟叶颜色由黄褐、浅褐到深褐;而雪茄烟烟叶多为深褐色,有的甚至近黑色。 烟草色素的总量和组成随烟草类型、品种、生长阶段、加工处理方法的不同而不同,生长过程中烟叶的色素主要有叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、新黄质、紫黄质和β-胡萝卜素。成熟烟叶中黄色色素,即胡萝卜素和叶黄素,烟叶在成熟特别是在调制和发酵过程中产生黑色色素。因此,根据烟草不同色素的颜色性质和对烟草品质的影响,一般可分为绿色素、黄色素、黑色素三大类。 (一) 叶绿素 已知的叶绿素类物质主要有叶绿素a、叶绿素b、叶绿素c和叶绿素d。高等植物中含有叶绿素a和叶绿素b,叶绿素在植物细胞

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蒸腾作用的生理指标及影响蒸腾作用的因素

  一、蒸腾作用的生理意义和方式      (一)蒸腾作用的生理意义      1.蒸腾作用能产生蒸腾拉力   蒸腾拉力是植物被动吸水和运转水分的主要动力。蒸腾作用对于高大的乔木尤其重要。   2.蒸腾作用促进木质部汁液中的物质运输   土壤中的矿质盐类和根系合成的物质可随着水分的吸收和集流被运输和分配到植物体的各部分。   3.蒸腾作用能降低植物体的温度   这是因为水的气化热高,在蒸腾过程中可以散失掉大量的辐射热。   4.蒸腾作用的正常进行有利于co2同化   这是因为叶片进行蒸腾时,气孔是开放的,由此成为co2进入叶片的通道。        (二)蒸腾作用的方式   蒸腾作用有多种方式。幼小的植物,暴露在地

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