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Access RT

相关专题 1)什么是Access RT-PCR ? 2)什么是Access RT-PCR 系统? 3)总RNA能否作为模板,是否一定需要poly(A)+RNA? 4)使用Access RT-PCR 系统需要的RNA的量是多少? 5)同一般常用方法相比较,Access RT-PCR 系统有哪些优点? 6)使用Access RT-PCR 系统需要优化哪些条件? 7)Tf1DNA聚合酶是否有反转录酶活力? 8)为什 Access RT-PCR系统不使用MMLV反转录酶而使用AMV反转录酶? 9)在使用反转录系统时,能否用氯化镁代替硫酸镁? ------------------------------------------------------------- 1)什么是RT-PCR? RT-PCR是将RNA模板的反转录(RT),和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广,可用于检测产生的转录产物,分析表达的水平,不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。 2

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我的RT

相关专题 我做的是人VI 型胶原蛋白α1 链的克隆 流程和实验结果如下,给做RT-PCR 的战友一点参考。 首先引物设计 引物设计 有3 条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度(primer length),产物长度 (product length),序列Tm 值 (melting temperature),引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用ΔG 值反映),形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值,在错配位点( false priming site ) 的引发效率, 引物及产物的GC 含量(composition),等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。根据有关参考资料[24],引物设计 应

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四步法消除SYBR Green Ⅰ实时定量RT

相关专题 张驰宇1 ,2) ,  张高红1 ,2) ,  杨 敏1) ,  贲昆龙1) 3 (1) 中国科学院昆明动物研究所 分子与细胞免疫学实验室,昆明 650223 ;2) 中国科学院研究生院,北京 100039) 摘要 为建立一种新的SYBR green Ⅰ实时定量RT-PCR 方法,使之能够有效消除引物二聚体(PDs)对实时定量结果的影响. 对RT-PCR 特异性扩增产物和PDs 分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析. 依据PDs 和扩增产物的熔解温度( Tm) 特点,在通用的三步法的延伸步骤之后,增加一个短暂的(5 s) 恒温和荧光检测步骤,使这个步骤的温度高于PDs 的Tm ,但低于扩增产物的Tm ,简称该法为四步法. PDs 的Tm 通常高于72 ℃,但低于扩增产物的Tm . 将四步法第四步的温度设置在高于PDs 的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时,四步法能够有效地消除PDs 的影响. 对三步法和四步法SYBR green Ⅰ实时定量RT-PCR 进行了比较,发现三步法根本不能用于RNA 的实时定量,而四步法能够实

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原位PCR和原位RT

相关专题 (一)、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪 。 (二)、操作流程 1、原位PCR 步骤 1)预处理: (1)切片常规脱蜡; (2)0.2mol/L HCl处理10min; (3)5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min; (4)Nase消化组织37℃ 30min; (5)梯度酒精脱水,室温干燥。 2)原位扩增: (1)切片滴加特异性序列引物30μLPCR 扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边; (2)PCR 热循环:94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min,共25~30个循环,72℃延伸10min; (3)氯仿洗去盖玻片,4%多聚甲醛后固定10min,梯度酒精脱水,干燥。 3) 原位杂交: (1)加地高辛标记探针的杂交液,98℃变性10min,-20℃退火5min,42℃杂交过夜。 (2)杂交后用2×SSC洗涤10min,3次,1×SSC洗涤10min,3次; (3)缓冲液洗涤10min,3次; (4

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基因组DNA Southern杂交

相关专题 1)基因组 DNA Southern印迹的制备 预备 1.用适当的限制性内切酶消化基因组 DNA样品(10μg)。 2.进行琼脂糖凝胶电泳。一般用0.7~1.0%的琼脂糖凝胶分离基因组DNA,它在1~15kb的范围内有较好的分辨率,可选用TBE或TAE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行,如果要分离片段大小相似的DNA带,应用较大的凝胶(20×25cm)。常用的标准品是由Hind Ⅲ消化的λDNA、Hae Ⅲ消化的ΦX174 DNA和100或1000bp的梯形图谱 。电泳完毕,将凝胶放在紫外透射仪上,并在凝胶旁放一尺子进行拍照。当把凝胶从盘内移动紫外透射仪时,小心不要将凝胶滑落或弄破。 Southern印迹的制备 1.将凝胶转移至塑料盒内。 2.加入至少4倍凝胶体积的0.25mol/L HCl使DNA脱嘌呤,置室温摇床温育15min。这时凝胶上样缓冲液中的溴酚蓝应变黄色,如果15min后仍呈蓝色,应再温育5min。 3.小心地塑料盒内HCl弃去,用蒸馏水漂

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基因定位的方法

相关专题 1.体细胞杂交法 体细胞是生物体除生殖细胞外的所有细胞。 将从身体分离的体细胞做组织培养进行遗传学研究的学科称为体细胞遗传学(somatic genetics)。体外培养细胞可人为控制或改变环境条件,并可建立细胞株,长期保存,进行各种正常和病理研究。与基因定位有关的是体细胞杂交(somatic cell hybridization)。细胞杂交又称细胞融合(cell fusion),是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。大多数体细胞杂交是用人的细胞与小鼠、大鼠或仓鼠的体细胞(hybrid cell)进行杂交。这种新产生的融合细胞称为杂种细胞(hybrid cell),含有双亲不同的染色体。杂种细胞有一个重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留啮齿类一方染色体而人类染色体则逐渐丢失,最后只剩一条或几条,其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。由于人和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学 特征,Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征,证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶(TK)。

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基因重组中涉及到的各种方法一览

相关专题 DNA重组 是整个基因工程中的关键,其中所涉及到的主要反应,以及每个步骤中溶液的配制数据等不少,本文对其中的质粒提取鉴定、分子杂交、基因转移、DNA制备等实验方法作详细介绍。 一、质粒 DNA的提取及鉴定 (一)质粒 DNA的提取及鉴定 1.收获细菌 (1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中,接入一单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。 (2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中,用台式离心机 于4℃以12000g离心5min,将剩余的培养物贮存于4℃。 (3)吸尽培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。 2.碱裂解法小量抽提质粒 (1)将细菌沉淀[上述步骤(3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中,剧烈振荡。 (2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS),缓和振荡,水浴5min。

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核酸分离与纯化的原理及方法

相关专题 核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子 生物学的一项基本技术。随着分子 生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域,核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现,极大地推动了分子生物学的发展。现就核酸分离与纯化的原理及其方法学进展作一综述。 核酸分离与纯化的原则 核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。 核酸分离与纯化的步骤 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。 1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。 (1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机

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限制性片段长度多态性RFLP

相关专题 随着对基因认识的不断深入,发现在同种生物的不同个体之间,尽管其蛋白质产物的结构和功能完全相同或仅存在着细微的差异,但在DNA水平却存在着差异,尤其在不编码蛋白质的区域以及没有重要调节功能的区域表现更为突出。这种不影响生物体表型的DNA突变 被称为中性突变 。 分子 生物学技术的不断发展已使得从DNA水平直接分析这类突变成为可能。 目前应用较多且成熟的方法是限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)。即当DNA序列中某一个碱基发生突变,使突变所在部位的DNA序列获得或丢失某种限制性核酸内切酶位点;或当DNA分子内部发生较大的顺序突变如缺失、重复、插入,或DNA高变区内某串联重复顺序的拷贝数不同致使其两侧限制性核酸内切酶位点发生相对位移时,利用相应的限制性核酸内切酶消化此DNA,便会产生与正常不同的限制性片段。这样,在同种生物的不同个体中就会出现不同长度的限制性片段类型。 因为DNA的中性突变常以孟德尔显性遗传方式遗传给下一代,所以对

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DNA的限制性酶切及电泳分析

相关专题 实验目的:   1.掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。   2.掌握重组 质粒DNA的酶切鉴定方法。   3.掌握琼脂 糖凝胶电泳分析酶切结果。 基本原理   限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶(水解磷酸二酯键)。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性,可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。 主要试剂   重组 质粒DNA 插入片段300bp   本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ,其识别顺序为:   5′----G↓AATT C----3′   3′----C TTAA↑G----5′ 磷酸二脂键断裂 产生5′粘性末端。 操作步骤 1. 反应体系的建立: ⑴ 在一无菌1.5 ml eppendorf 管中加入:   无菌双蒸水 7 μl   10×酶切缓冲液 2 μl   质粒 DNA(100 ng/μl) 10 μl   EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl   总体积为20μl   ⑵ 轻

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大肠杆菌的转化及重组菌的筛选

相关专题 一、 实验目的 学习和掌握转化大肠杆菌 的通用方法,并进行转化子的筛选 二、 实验原理 转化(transformation)是将一种生物(供体)的遗传物质(通常为DNA)转入另一种生物(受体)并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。大肠杆菌不是天然感受菌,在低温(0~5℃)环境下经CaCl2处理,细胞壁变松变软后能摄入外源DNA,这种状态称为感受态细胞(competent cell)。经CaCl2处理后大肠杆菌与外源DNA混合进行42℃短时间的热激可利于外源DNA转化 ,然后再经过恢复和筛选,选择转化子。 三、实验材料 E.coli (受体) PBS K+质粒DNA 四、实验仪器、器皿及试剂 1.仪器:低温冷冻高速离心机 、恒温水浴箱、超净工作台、冰箱 2.器皿:eppendorf 离心管、微量加样器及Tip 、乳胶手套 3.试剂:LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素、0.1mol/l CaCl2溶液 五、实验步骤 1.从甘油保存菌种中接种一环 E.coli至LB平板上

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核酸提取(The Extraction of Nucleic Acid)

相关专题 【实验目的】 1.掌握核酸提取的基本原理和基本方法 2.掌握检测核酸浓度及纯度的原理及方法 【实验原理】 DNA是遗传信息的载体 ,是最重要的生物信息">生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取 方面的工作,那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到:1、根据不同研究需要,保证结构的相应完整性;2、尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等);3、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。 核酸的提取关键是去除蛋白质,通常情况下,先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后,再用有机溶剂抽提,在单价阳离子存在下,核酸在乙醇中形成沉淀。 作DNA或RNA定量时,应在260nm和280nm两个波长下读数。在260nm的读数用于计算样品中的核酸浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA,40μg/ml单链DNA或RNA及大约20μg/ml单链寡核苷酸 。根据在260nm以及

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DNA重组技术(Recombinant DNA)

相关专题 【实验目的】 1.掌握DNA重组 技术的基本原理和基本方法 2.熟悉质粒 DNA的小量制备及酶切鉴定方法 【实验原理】 1.DNA重组 技术 重组 DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术,也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤: 1)重组 DNA分子的构建:即将目的基因(DNA或cDNA片段)与载体DNA重组,应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下,目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。 2)将重组DNA分子转化宿主细胞。 3)克隆选择增殖:将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面,培养基中含有宿主菌敏感的抗生素,重组DNA(TA克隆载体分子)含有相应抗生素的抗性基因,转化的细菌能在

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已知基因序列的获取策略——兼谈引物设计与序列分析

相关专题 引物设计 专栏: http://ask.bbioo.com/special/experiment/PrimerDesign.htm 一、如何获取已知目的基因的序列信息 先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能(www.expasy.org) 进一步查找其核酸相关序列信息,常用数据库:Genebank、EBI、DDBJ 二、目的基因cDNA序列的获取方法 cDNA文库 扫描 RT-PCR 人工合成 组织RNA的提取 -在匀浆器中加工冷冻的组织 -通过注射器加工冷冻的组织 -在液氮中将组织研磨成粉末 -在液氮中研磨组织至粉末状,细胞裂解更完全,产量比前二者多一倍。 -合适的RNA提取 方法加上合适的组织处理方法,才能够获得最佳的提取效果 RNA提取 两要素 忌讳贪多 :不能指望1ml Trizol 提取100mg以上组织,一般50mg用1mlTrizol较合适 速战速决 :尽量缩短提取时间,不

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DNA 序列分析技术

相关专题 物种 的遗传多样性在本质上是DNA 一级序列的多样性。近年来,随着DNA 测序技术的迅速发展和日益普及,DNA 测序在遗传多样性的研究中正在起着越来越大的作用。本章将介绍目前在遗传多样性研究中常用的一种手动和一种全自动双链DNA 测序方法。 1 DNA 模板的制备 在遗传多样性的研究中,由于样本量一般都较庞大,因而DNA 测序 的速度就成了很关键的因素。因此,这类研究中常常直接测定纯化的PCR 双链产物而不大采用克隆技术。本节介绍本实验室常用的从PCR 产物制备测序模板的方法,即低熔点胶回收法。 (1)制备1.5%~2.0%的琼脂 糖凝胶,待其充分凝固后,在离点样线5cm 左右处切下宽约1cm 的胶条,在切出的槽中倒入预先煮沸的低熔点琼脂糖胶。 (2)低熔点胶凝固后,将待纯化的PCR 反应液全部点样,恒压100V 左右进行电泳,直至扩增片段进入到低熔点胶中部。在360nm 紫外光下,将已进入低熔点胶的条带切下,放入1.5ml离心管中。 (3)离心,将胶块压缩到管底,然后补加 TE 至 500μl。于 6

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Termal Asymmetric Interlaced PCR(TAIL

相关专题 很早就有用随机引物的PCR ,但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生,所以一直未能广泛应用。近年来由IJiu等设计的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)又叫热不对称交错PCR,则解决了这个问题,后来有研究表明,经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列,从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。   在利用特异引物和随机引物进行PCR 中一般有3种产物生成:(1)由特异性引物和简并引物扩增出的产物;(2)由同一特异性弓l物扩增出的产物;(3)由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中,其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。   TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprimer,简称sp1,sp2,sp3,约20bp),用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerate prime,AD,约14bp)相组合,以基因组

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几种转染方法对比

相关专题 总有一种转染方法适合你 转染 方法 原理 主要应用 特点 厂家及产品 DEAE-葡聚糖法 带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 瞬时转染 相对简便、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit) 磷酸钙法 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜 被细胞内吞 稳定转染,染瞬转染 不适用于原代细胞(所需的DNA浓度较高),操作简便但重复性差,有些细胞不适用 细胞建议用CSCL梯度离心,转染是拷贝数较多 GIBCO B

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DNA双螺旋与分子

相关专题 DNA双螺旋结构的前前后后   詹姆斯 沃森 《双螺旋 ——发现DNA结构 的故事》   DNA双螺旋与分子   豌豆品种进行杂交实验的结果。孟德尔曾经研究过圆形和皱形种子,红花和白花等性状在子代植物 中的分布情况。他的杂交实验结果使他得出了有机体携带着并传递给子代很多遗传因子或称基因的著名结论。每一个基因决定一个性状,因此有机体的全貌受其全部基因的控制,而这些基因都是由其亲代传授下来的。   孟德尔的见解远远超越了他的时代,以致他的发现在以后35年内没有引起的大量工作。此外,他们还发现了基因能够进行突然的、永久性的变化或称突变 。一个突变 可以导致由基因所决定的特定遗传性状发生变化,例如红花颜色变为白花颜色。   这些实验结果大大推动了对于生命的认识。从理论上来说,它为了解种以前不知道的合磷丰富的物质——核酸。到本世纪初,文字形式发表了这种观点。但是,直到1961年,才最后证明遗传密码确实含有一种语言,在这种语言中,DNA的多核苷酸 链在多肽翻译过程中念为3X3。克里克是用

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寡核苷酸探针的类型、优点及非放射性标记方法

相关专题 不少的生命科学关键实验中都会用到寡核苷酸 作为标记,因而对于这一名词进行充分的了解显得尤为重要。本文从寡核苷酸探针的类型、优点、标记方法三方面对这一技术进行详细的介绍。 常用的寡核苷酸 探针有3种: ①特定序列的单一寡核苷酸探针;②较短的简并性较高的成套寡核苷酸探针;③较长而简并性较低的成套寡核苷酸探针。多用32P标记寡核苷酸探针,如:1)通过T4噬菌体多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记合成的寡核苷酸探针,在合成寡核苷酸时期5’端缺少一个磷酸基,因而易用T4噬菌体多核苷酸激酶进行磷酸化反应,而将α-32P从[γ-32P]ATP转移至其5’端。这种磷酸化反应最多能使每一寡核苷酸分子中掺入一个32P原子。2)用大肠杆菌DNA聚合酶 i Klenow片段标记合成的寡核苷酸探针,其比活性更高,每一寡核苷酸分子可带有若干个放射性原子,放射性比活度可高达2×1010计数/(min·mg)。 利用寡核苷酸 自动合成仪,可很简单地合成制备寡核苷酸探针(如15~50bp),寡核苷酸 类探针具有以下优点 :①短的探针比长探针杂

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秘籍特献:寡核苷酸与PCR引物设计

相关专题 好的开始是成功的一半,引物对于整个PCR 实验的成功与否就起着非常关键的作用。本文对其中的重要因素——寡核苷酸的详情及其与PCR实验的整个关系做一介绍。希望对大家的实验有所启发。 1.简介 寡聚核苷酸引物的选择,通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生,甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组 模板。引物设计也极大的影响扩增产量:若使用设计粗糙的引物,产物将很少甚至没有;而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然,即使有了好的引物,依然需要进行反应条件的优化,比如调整Mg2+浓度,使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。 计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等,易于在计算机软件 中被编码和限定。计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引

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