相关专题 一．实验目的 1．以pGLO质粒 转化大肠杆菌为例，学习转化的基本原理及方法。 2．验证DNA是遗传物质 ，加深对中心法则的理解。 二．实验原理 转化（transformation）是指一段同源或异源的DNA转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程 不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。本实验是用pGLO细菌转化试剂盒中提供的pGLO质粒来转化大肠杆菌，所用方法为CaCl2转化法。 pGLO质粒 ： pGLO质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。此外，该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达 的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。 三．实验材料 受体菌

相关专题 实验内容 采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA,并进行纯度分析和琼脂 糖凝胶电泳. 目的要求 掌握CTAB法从植物 叶片提取DNA的原理和方法. 实验原理 1,原理 核酸是生物有机体中的重要成分,在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在.核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类,在真核细胞中,前者主要存在于细胞核 中,后者主要存在于细胞质及核仁里.在制备核酸时,通过研磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来. 在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很 小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质

相关专题 焦磷酸测序 (Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。 Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应（参见Pyrosequecing的原理），在每一轮测序 反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。 PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸 数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。 瑞典Pyrosequencing AB公司基于Pyrosequencing技术而研究开发的PSQ 96系统是一个理想的遗传分析技术平台，它既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的SNP 检测及等位基因频率测定。我公司是国内最早引进PSQ 96 MA 技术平台的公司之一，它具有以下优点： 测序 不需要制胶，不需要毛细管，也

相关专题 PCR 的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题。今天我们把相关内容整理出来，与大家共同讨论，希望对大家能有所帮助。 一、引物设计所谓“工欲善其事，必先利其器”，这年头手工设计引物的人似乎不多，还是用软件 方便些，防止你一不小心看走眼，丢一个碱基，同时计算起来也方便。设计软件有很多，既可以在线设计（如Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。1. 引物设计的原则细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同时扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：1）典型的引物18 到24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，

相关专题 随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR ）、以及进一步改进的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。 差别显示ＰＣＲ是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR 扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。 差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。如在19

相关专题 PCR 基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组 或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。 表1. 反应成分 ComponentFinal ConcentrationTemplate10^4-10^6 copie

相关专题 错配PCR -限制性片段长度多态性分析检测HBV前终止密码变异株 技术的建立及临床应用 　 周伯平 徐六妹 王火生 付涌水 李卫宁 韩红星 马为民 袁 静 深圳市东湖医院 深圳市肝病研究所 518003 　 摘要 采用错配聚合酶链反应(mpPCR)对HBV前C区基因进行扩增，对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP)，鉴定前C区第83位核苷酸点突变。并对PCR产物进行核苷酸序列分析以鉴定其特异性。通过对不同含量HBV DNA&127;的阳性血清检测结果显示本法可检出105copies/ml的HBV DNA，测序 结果证实PCR产物为HBV前C区特异性序列，与RFLP分析结果相符。采用mpPCR-RFLP对74份慢性乙型肝炎患者血清进行检测，结果17例前C区终止密码变异(23%)，其中8例抗-HBe&127;阳性的变异株感染者有1例为慢性重症肝炎；5例肝功能反复异常，提示多数前C区变异株HBV感染者伴有活动性肝病。采用本法检测前C区变异株HBV感

相关专题 　　幽门螺杆菌（Hp）感染在人群中广泛存在，Hp的分型鉴定对其感染的临床及流行病学研究具有重要意义。国外文献报道的几种基因型技术使Hp的分型鉴定成为可能，而PCR 及单链构象多态性（Signle-strand conformation polymorphisms,SSCP）分析在菌株分型鉴定中的应用则尚未见报道。作者采用PCR-SSCP分析区分不同来源的Hp，并探讨其应用价值。 　　1 材料和方法 　　1.1 菌株来源 Hp标准菌株NCTC11637，NCTC11848来自英国伦敦国家标准培养物收藏中心，由本院传染科保存并提供；112株临床分离鉴定的Hp来自97名因上胃肠症状在本院行胃镜检查的病人，经内镜及病理诊断证实十二指肠溃疡49例，胃溃疡5例，慢性胃炎43例。所有病人在内镜直视下于胃窦取粘膜活组织一块做细菌培养，其中包括1例未经治疗相融8个月复查胃镜者，4名病人还另于胃底或十二指肠球部取粘膜活组织一块做细菌培养，10例十二指肠溃疡伴Hp感染者于抗生素治疗停药4周复查胃镜，取胃窦粘膜活组织两块分别做细菌

相关专题 【实验目的】 掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法 【实验原理】 DNA分子 中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，其反应如下图。 蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。 【实验材料】 1.实验器材 恒温水浴,721分光光度计 。 2.实验试剂 (1)DNA标准溶液：准确称取小牛胸腺DNA10mg，以0.1mol/L NaOH溶液溶解，转移至50ml容量瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液稀释至刻度。浓度为200µg/m1; (2) DNA样品液：用上述实验方法提取的DNA样品 (3)二苯胺试剂：使用前称取1g结晶二苯胺，溶于100m1分析纯冰醋酸中，加60%过氯酸10m1混匀。临用前加入1m1 1.6%乙醛溶液。此溶剂应为无色。

相关专题 一、 目的 熟练掌握抽提细菌 DNA的一般方法 二、原理 要进行重组 DNA 实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体 DNA上制备，所以制备高质量的染色体 DNA样品经常为基因工程 实验所需要，抽提细菌染色体DNA的方法目前已有许多种，这里所介绍的两种方法：一适用于枯杆菌染色体的抽提;另一种方法则适用于大肠杆菌 染色体的制备。 基因工程实验所需要的基因组 DNA 通常要求分子 量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA 非易事，细菌基因组 DNA通常是个很大的环状态DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA 分子 ，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性;分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。 另外制备的细菌染色体DNA 必

相关专题 自然界绝大多数生物体的遗传信息贮存在DNA的核苷酸 排列顺序中。DNA是巨大的生物高分子 ，一般将细胞内遗传信息的携带者棗染色体 所包含的DNA总体称为基因组 (genome)。同一物种 的基因组 DNA含量总是恒定的，不同物种 间基因组大小和复杂程度则差异极大，一般讲，进化 程度越高的生物体其基因组构成越大、越复杂，见表。 某些有代表性的生物体内DNA大小 　 　 分子量 碱基对（bp) 千碱基对(kb) 最简单的微生物 SV40病毒 3×106 5×103 5 　 λ噬菌体 3.4×107 5×104 50 细菌

相关专题 【实验目的 】 学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法 【实验原理 】 1.从动物组织和细胞中提取DNA DNA存在于细胞核中。提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂 糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。 2.从动物组织和细胞中提取RNA RNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子 。为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋

相关专题 实验目的 1. 学会DNA限制性内切酶 酶切技术。 2. 琼脂 糖凝胶电泳法观察酶切DNA的结果。 实验原理 质粒pUC118上有限制性内切酶BamHI的识别序列G↓GATCC，用BamHI酶切后形成线性质粒DNA。琼脂 糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。要准确地确定DNA片段的大小，必须用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准是lDNA/Eco RI、lDNA/Hind III、lDNA/Eco RI+Hind III的酶切片段 实验材料和试剂 （一）实验材料 实验二提取的质粒 pUC118 （二）试剂 1．限制性内切酶 BamHI 2．l DNA/Hind III分子量标准 3．双蒸馏无菌水 4．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 5．1mg/ml溴化乙锭溶液 6．电泳缓冲液（TAE） 7．0.7% 琼脂糖凝胶（用TAE电泳缓冲液配制） （三）器材

相关专题 Autoclave method for rapid preparation of bacterial PCR -template DNA 用高温高压灭菌锅法快速制备细菌PCR 模板DNA Keith E. Simmon, Dewey D. Steadman, Sarah Durkin, Amy Baldwin, Wade H. Jeffrey, Peter Sheridan, Rene Horton, Malcolm S. Shields 指导老师︰ 王玮龙　林宗岐　林忠毅　黄世杰　赖吉永老师 (按笔划) 报告者︰ 91230012　林俊晔 91230015　郭孟儒 91230023　王浚楷 报告日期：2005 . 5 . 24 出处： Journal of Microbiological Methods 卷号：56 　　 页数：143－149　共 7 页 年代：2004　 Impact Factor：2.015 期刊分类：Microbiology 期刊排名：34/

相关专题 目的：了解紫外吸收检测 DNA 浓度与纯度的原理，掌握测定方法。原理：核酸的最大吸收波长为 260 nm，蛋白质为 280 nm，在波长 260 nm 时，1 OD 值相当于双链 DNA 浓度为 50 μg/ml，单链寡核苷酸的含量为 30 μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在 260 nm 和 280 nm 的 OD 值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净 DNA 的比值为 1.8, RNA 为 2.0。若比值高于 1.8 说明 DNA 样品中的 RNA 尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270 nm 存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25 μg/ml 的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。试剂与仪器：提取的质粒 DNA、紫外分光光度仪操作步骤：1) 分光光度计先用水在 260 nm 和 280 nm 两个波长下校零。2) 取质粒 DNA 样品 2 μl，用水稀释 100 倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3) 在 260 nm 和 280 nm 分别读出样品光密度值。如果样品

相关专题 一．实验目的及背景 在生物技术实验中，PCR反应获得的目的片段，酶切后所得特定的DNA序列， 分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它DNA分开， 这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的DNA， 以用于以后分子杂交，重组 子构建，序列分析等. 从凝胶中分离回收DNA的方法 现在常用的技术有： 电洗脱法 低熔点琼脂 糖凝胶法 DNA滤膜插片法等 其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对DNA的回收效果好。 低熔点琼脂 糖凝胶法 65oC琼脂 糖凝胶熔点 低熔点琼脂 糖凝胶 37oC 液体 DNA滤膜插片法 High efficient DNA high quality for microinjection <5kb fragment 100ng DNA fragment 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes 0.5 mol/L NaOH 5 minutes

相关专题 (辽宁省刑事科学技术研究所 　沈阳　110032) 摘　要　DNA 多态性分析技术是当前法医生物物证鉴定中最主要的技术手段,并由此诞生法医分子 遗传学这一新生学科。本文对法医DNA 多态性分析技术的诞生、技术种类、科研进展、重大应用进行综述报道。 关键词　DNA 多态性分析　法庭科学　进展与应用 1 　法医DNA 分析技术的诞生和发展 DNA 是脱氧核糖核酸的英文缩写,几乎是所有生物的基本遗传物质。1953 年4 月25 日,美国科学家James.waston 和英国科学家Francisco. crick ,在英国《自然》杂志正式提出DNA 分子的双螺旋结构模型,使DNA 成为现代生物学与医学中最重要的研究内容之一。随着DNA 结构被阐明,诞生一系列的DNA 检验技术并迅速在许多研究和应用领域发挥重要的作用。1985 年英国Leister 大学的遗传学家Alec. Jeffreys 教授首次报道DNA 指纹图技术标志着法医DNA 分析技术的问世。DNA 指纹图技术一经应用,就迅速在多起重大的刑事犯罪侦破和民

相关专题 实验目的 从上个实验中转化成功的军中提取出已经到克隆 的质粒，为下一步双酶切做好准备。 我们重点是要保证治理的序列、产率和纯度，去除Dnase、机械、物理、化学因素的影响。 并且学习和掌握碱裂解法 提取质粒的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 实验原理 1将含pETBlue－2的单菌落接入3mL LBAmp+液体培养基中，37℃振荡培养过夜。让菌苏醒，增加菌的数量。 2培养的菌液，6000rpm，离心2min。去上清收集沉淀。收集、浓缩菌体。 3100 uL溶液I充分重悬菌体。这一步仅仅是为了吹散细胞。 4200uL溶液II，反复颠倒混匀（切勿旋涡振荡！），冰上放置，裂解至菌液变清。 利用碱法破碎细胞和提取质粒 。 碱法破碎细胞是因为NaOH可以破坏细胞膜 糖苷键，SDS可以破坏膜、变性膜蛋白。 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变

相关专题 实验目的 从新鲜的小鼠肝脏中提取基因组DNA，为southern杂交或DNA文库 的构建做好准备。 我们重点是要保证DNA的序列、产率和纯度，去除Dnase、机械剪切 （对于如此之大的基因组 ，防止机械剪切是很重要的）、物理、化学因素的影响。 实验原理及过程 实验步骤 实验原理 1 将饥饿一天的小鼠用脊髓脱臼法处死。 饥饿一天是为了减少肝中的糖原，以免在提取DNA时糖的去除有太多困难。（试剂CTBA可以去除糖原） 2 0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组 DNA被降解。 因为DNA并没有提出来，所以在这时重要的是防止DNA酶对基因组 DNA的影响。 3 碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL匀浆液，匀浆6次（冰上操作）。 只

相关专题 一、实验目的 掌握植物 总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物 的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜 和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验材料