PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的产量. 　　传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜， 使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化 处理标本，视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定. 模板核酸的提取制备方法 　　(一)蛋白酶K消化裂解法： 适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等. 　　1.试剂配制 　　①蛋白酶K消化液:10

一、仪器设备英国 Thermo Hybaid 原位 PCR 仪。 二、操作流程1 、原位 PCR 步骤 1 ）预处理： （ 1 ）切片常规脱蜡； （ 2 ） 0.2mol/L HCl 处理 10min ； （ 3 ） 5 μ g/ml 蛋白酶 K 消化组织 37 ℃ 10min ； （ 4 ） Nase 消化组织 37 ℃ 30min ； （ 5 ）梯度酒精脱水，室温干燥。 2 ）原位扩增： （ 1 ）切片滴加特异性序列引物 30 μ LPCR 扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边； （ 2 ） PCR 热循环： 94 ℃， 1min ； 55 ℃， 1min ； 72 ℃， 1.5min ，共 25 ～ 30 个循环， 72 ℃延伸 10min ； （ 3 ）氯仿洗去盖玻片， 4 ％多聚甲醛后固定 10min ，梯度酒精脱水，干燥。 3) 原位杂交： （ 1 ）加地高辛标记探针的杂交液， 98 ℃变性 10min ， -20 ℃退火

增加PCR的特异性： 1. prime理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件 a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性 d. 避免3'端GC rich, 最后3个ｂａｓｅ不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端的错配 g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM) j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al. ~undefined

一. 样品的制备 1. 设计引物。用Oliga6.0对目的基因进行分析，设定引物，引物长度18-21个碱基，扩增片段以200-300bp最为合适。 2. PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。 3. PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ulSSCP上样缓冲液（变性缓冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加1ul，效果很好加0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2或3不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加3ul的PCR产物，缓冲液加到8ul变性效果更好。 4. PCR产物变性。加好的样品进行离心，使样品集中在管底。PCR仪上95变性5-10分钟，立即取出PCR产物连同架子一同置于冰上静置5min，以免变性的产物复性。 注：3和4步可以在制SSCP胶第四步后，等胶凝的过程中进行。 二. 制胶 1. 装板。

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、

摘要： 基因以及microRNA（miRNA）的研究离不开定量PCR技术。许多实验室都尝试采用各种液体处理工具以自动化qPCR应用中的某些或全部步骤。然而，由于qPCR应用在对包括液体处理，实验流程以及个性化设置等方面诸多的要求，市场上商业化的解决方案要么过于死板，无法实现特定应用的需求；要么过于复杂，令普通研究人员无法对其进行适当的修改来匹配自己的独特应用要求。为了解决这个难题，西班牙马德里的国立心血管病研究中心(Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, CNIC)的研究人员在Tecan Freedom EVO自动化工作站平台上开发了一整套给予Excel与VB（Visual Basic）脚本的用户支援平台AG（AutomaticGenomics）。该平台采用简单明了的Excel界面，允许用户自由地设计各种qPCR试验（例如待扩增基因数，样本/质控样本数，模板分子体积及总反应体积，PCR板内样本分布/拷贝数等），并能够将设计好的实验自动翻译成Freedom EVO的应用脚本，实现从qPCR的设计，加样，到结

荧光色素标记抗体 1． 准备好凝胶滤柱以便完成结合反应后用于分离标记抗体和游离的荧光色素。分离球形蛋白使用排除极限为 20 000 ～ 50 000 的凝胶介质和细粒级凝胶（直径约 50 μ m ）。所需凝胶滤柱的大小可根据偶联反应的总体积× 20 来确定。依据厂家说明准备好滤柱，用 20 倍柱床体积的 PBS 灌注滤柱，直至缓冲液水平刚好降至低于柱床顶部，关闭滤纸底部的阀门或用塑膜黏土（或 parafilm ）封闭底端以使滤柱不再流动。 2． 用 0.1mol/L 的硼酸钠或碳酸钠配制浓度至少为 2mg/ml 的抗体溶液（ pH9.0 ）。应避免引入含一级胺的外来分子。 3． 用无水 DMSO （优级纯）溶解 FITC 或 TRITC 至 1mg/ml 。每次标记反应时新鲜配制。 4． 每 1ml 蛋白溶液加 50 μ l 染液。染液须以每次 5 μ l 缓慢加入，加入时应轻轻地连续搅拌混匀。 5． 置 4 ℃避光反应 1h 。 6． 加氯化铵至 50mmol/L ，室温孵育 2h 。加入 0.1 ％二甲

一、 概述 可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。沉淀反应的发生机制与凝集反应基本相同。不同之点是：沉淀原分子小，单位体积内总面积大，故在定量试验时，通常稀释抗原。 沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和琼脂扩散反应。 环状沉淀反应是最早的沉淀反应，目前在链球菌的分类、鉴定，昆虫吸血性能及所吸血液来自何种动物的鉴别，肉品种属鉴定及炭疽尸体与皮张的检验工作中仍然应用。主要是用已知的抗体诊断未知的抗原。 絮状沉淀反应是将抗原与血清在试管内混合，在电解质存在的情况下，抗原抗体复合物可形成混浊沉淀或絮状沉淀凝聚物，此法通常用于毒素与抗毒素的滴定。 琼脂凝胶免疫扩散（Agar－gel immunodiffusion）是沉淀反应的一种形式，是指抗原抗体在琼脂凝胶内扩散，特异性

1. 细胞凋亡与白血病 Activation of Apoptosis in Vivo by a Hydrocarbon-Stapled BH3 Helix SCIENCE 2004，305:1466-1470 通过对BCL-2蛋白家族BID的BH3结构域进行化学修饰，使其容易穿过细胞膜，在活体内研究其激活血癌细胞发生凋亡的功能和机制。 2. 肿瘤发生 Suppression of anoikis and induction of metastasis by the neurotrophic receptor TrkB NATURE 2004，430:1034-1040 利用荧光素酶基因标记的癌细胞，研究神经营养性受体TrkB抑制细胞凋亡和促进肿瘤发生和转移的作用。 3. 肿瘤转移 Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATIO

可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。基本类型有单向扩散和双向扩散两种。 （一）双向琼脂扩散试验（Double immunodiffusion test） 抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。 【材料】羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。 【方法】 1、用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。 2、待琼脂凝固后，按右图用打 孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂 （孔距为5mm）。 3、在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小

抗原的制备 　　除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。 　　一、抗原的提取 　　抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选

菌种保存方法 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 　　低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 　　保藏方法大致可分为以下几种： 　　1．传代培养保藏法 　　又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4―6℃冰箱内保存。 　　2．液体石蜡覆盖保藏法 　　是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 　　3．载体保藏法 　　是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 　　4．寄主保藏法 　　用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒

自从1898年贝杰林克（Beijerinck）首次提出“病毒”的概念以来，已经过去100多年时间。病毒的种类由最初的几十种、几百种，发展到今天的4000多种，为了使如此多的病毒种类能够得到科学的命名和分类，国际病毒分类委员会(International Comittee on Taxonomy of Viruses, ICTV)已提出和多次修订了病毒的命名和分类原则，并且建立了由目、科（亚科）、属和种分类阶元构成的病毒分类系统。目前病毒分类学这一门重要的基础学科已开始走向完善和逐渐成熟起来。 一、病毒的命名与分类系统进展概况 　　病毒分类学是随着病毒学尤其是分子病毒学的发展而建立起来的，并逐渐走向成熟。 病毒的分类和命名大事记 1937年 Levaditi和Lepine就曾根据病毒对组织的亲和性进行分类。 1948年 Holmes提出根据病毒所引起的宿主症状的分类方案。 1950年 第五届国际微生物学会提出了有关病毒分类的8项原则。 1963年 国际微生物命名委员会病毒分会根据安德鲁斯(Andrewes)提出的分类建 议提出了新的8项分类原则： ① 核酸的

厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。　　 1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。 3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外

单克隆抗体细胞融合 （一）融合剂 细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。 聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1 000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4 000者，常用浓度为50％，pH8.0～pH8.2（用10％ NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50％浓度，pH偏碱时融合效应最高。 也有采用30%～50％浓度的PEG加上10％二甲亚砜。 不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。 （二）融合过程 融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。 1．试剂与材料 (1) 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细

（一）抗体检测 用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多，从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的，而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的，所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下： １．试管溶血反应检测法 （1）材料：①杂交瘤细胞，换液后至少两天才收取培养液；②绵羊红血球，洗涤三次后，配成1％悬液；③豚鼠补体，无菌采取补体，以pH7.2PBS稀释成20％溶液，分装小瓶，于�40℃保存。使用时以补体和压积红血球5:1（V/V）的量进行吸收，4℃30min，然后2 000r/min离心10min，去红血球，取上清液备用；④0.01Mol/L pH7.2PBS液。 （2）操作方法：①在小试管中，加入0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液，再加入0.1ml pH7.2的PBS液，然后倍比稀释至一定的稀释度；②加入0.1ml补体和1％绵羊红血球0.1ml，混匀后置37℃水浴1h；③观察结果，以绵羊红血球完全溶解

抗原的制备 　　除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。 　　一、抗原的提取 　　抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选

染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation,ChIP)是研究体内ＤＮＡ与蛋白质相互作用的重要工具.它可以灵敏地检测目标蛋白与特异ＤＮＡ片段的结合情况,还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系.核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些共价修饰与真核基因的表达密切相关.根据“组蛋白密码”假说,组蛋白的各种共价修饰的组合,会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能因此,ChIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用,全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。 真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制 --"组蛋白密码"，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。参与修饰的酶根据

顶 楼 标题: 酶联免疫斑点(ELISPOT) FAQ FAQ： 关于酶联免疫斑点(ELISPOT) -------------------------------------------------------------------------------- Frequently Asked Question 酶联免疫斑点(ELISPOT) FAQ -------------------------------------------------------------------------------- 第一部分：关于ELISPOT 1． 什么是ELISPOT检测? 答:酶联免疫斑点 ( e

一、材料和试剂 1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。 2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。 3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。 4、0.01M PH7.4 PBS 5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20） 6、AEC底物 （1）底物缓冲液（20X） PH 4.6 醋酸（分子量60.6） 30.6ml Triton -100 醋酸钠 3H2O（分子量136.1）66.68克 加蒸馏水到960ml，调PH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml （2）AEC（20X） AEC 15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中） （3）0.6% H2O2（20X） 临用时，（1）（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。 7、DAB（即DAB-4HCL） （1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X） （2）1M Tris（20X），用HCL调PH到7.4 （1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，3