陈文学 邹学森 陈岳青 黄秀珍 钟礼瀑 （江西省肿瘤医院 肿瘤研究所， 江西 南昌 330029） [摘要] 荧光定量PCR技术具有简便、灵敏、准确等优点，目前已经在乙肝和性病的诊断和治疗中得到了广泛的应用，但在肿瘤方面的应用还处在研究和开发阶段。本文综述近年国内外相关荧光定量PCR技术在肿瘤研究中的应用。 [关键词] FQ-PCR；肿瘤；人乳头瘤病毒；EB病毒 肿瘤是危害人类健康的一种疾病，它的恶性程度与预后判断主要依靠是否有转移和病理切片分期。随着分子生物学的迅猛发展，肿瘤研究领域的大量研究成果显示，肿瘤的发生、发展、治疗和预后与肿瘤细胞内部基因和肿瘤相关病毒有关。本文综述了荧光定量PCR技术的原理及其在肿瘤研究中的应用。 1.单管荧光定量PCR技术的原理 单管荧光定量PCR（fluorogenic quantitative PCR, FQ PCR）的反应体系中除了普通PCR所需的引物外，还有一条荧光探针，探针的5`端标记了荧光报告基团，3`端标记了荧光淬灭基团，当这条探针保持完整时，荧光淬灭基团抑制荧光报告基团发出荧光。PC

Primer Premier 4.10 Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif）。这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功能的介绍请参看Plasmid Premier2.02。 打开程序首先进入的是序列编辑参看，与Plasmid Premier相比，其多了一个语音校正的功能，即在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校正，保证输入的正确和快速。 点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。 该界面共分为四层，最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑；右边是观察两个引物在模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择；第二层是显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显

做RNA病毒基因的RT-PCR成败的关键首先在于RNA模板的制备。本人三年前做过一个正链RNA病毒全基因组分段扩增，设计方案是将全基因组分成7个片段，0.6kb-3.3kb不等，分别进行RT-PCR扩增，刚开始的三个月，我们课题组三个人辛辛苦苦，什么招都想过了，结果连一个片段都没有拿到。后来有一个周末，我一个人安安静静做了一天，PCR跑胶的结果足以让我兴奋一个月：一下子隐隐约约出了3个片段！！！紧接着把胶里的弱带切下，水溶并后做二次扩增(注：跑胶总会吧，在UV下，参照marker，将特异性高，且与预期大小相同的DNA带切出，放在一个ep管里，加入适量无菌水，用枪头将胶反复搅碎，高速离心，小心吸取2ul上清用作模板，进行第二次PCR扩增)很快，三个预期的片段都得到了理想的扩增。不到一个月，12kb的全基因组各片段全部收归囊下。 我这次成功的关键在于：提取RNA时，收集沉淀这一步。离心速度不要低于13000rpm（r=5cm），提高离心速度、延长离心时间，在离心前的沉淀也尽可能在低温下长时间进行，这些时我本人总结出来的经验。在后来的实验中，几乎每次RT-PCR都非常顺利，除了材料本身

1.PCR产物的电泳检测时间 　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 2.假阴性，不出现扩增条带 　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的

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定量PCR 定义 以参照物为标准对PCR终产物进行分析或对PCR过程的进行监测，来评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR相对定量→绝对定量， 手工操作→自动化检测， 灵敏度与特异性多有很大的提高。 定量PCR的可行性 定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 特定的待扩增基因片段 起始含量越大，则指数扩增过程越短 当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，扩增片段的含量通常是一样的。 理想的扩增结果：Y=A×2n Y为扩增产物量 A代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数 理论上PCR扩增效率应为100%，PCR产物随着循环的进行成指数形成增长 实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2倍增长。 Y= A（1+R）n R 代表扩增效率： R = 参与复制的模板/总模板 R在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。 A 在 1～105拷贝,循环次数n≤20次：R 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析 随着循环次数n的增加（>20次），R值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期 PCR反应的后期：PCR产物的指

基本PCR引物设计参数 引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。 ①引物长度； 特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。 总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。 ②引物的二级结构 包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于- 5.0

组织或细胞中的总 RNA, 以其中的 mRNA 作为模板 , 采用 Oligo(dT) 或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA. 再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增 , 而获得目的基因或检测基因表达 .RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级 , 使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能 . 该技术主要用于 : 分析基因的转录产物 , 获取目的基因 , 合成 cDNA 探针 , 构建 RNA 高效转录系统 . Trizol 法 RNA 提取步骤 标记 EP 管，分 3 组 第一组 EP 管加入氯仿 0.2ml ，二组加入异丙醇 0.5ml ，三组加入 75% 乙醇 1ml 1ml Trizol 、心或肺 50 ～ 100mg 、液氮依次加入到研钵

荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。 1 特点 FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。实验一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪。该仪器具有以下特点：①应用广泛：可用于DNA和RNA

聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下： 一、 定量PCR的基本原理： 在PCR实验条件下（Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板），经变性→退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数；Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n个热循环中其Ev是一致的话，经n个循环后的扩增产物的分子数（Y）和反应物中原始分子数（X）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n。 1. 终点法定量原理： 在最佳实验、循

前言 一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR (Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。 何谓PCR 简单的说，PCR 就是利用DNA 聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用DNA 聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。 PCR 的要素 基本的PCR 须具备１.要被复制的DNA 模板 (Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA 聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。PCR 的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of pr

1.Marker选择标准 （1）应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。 （2）所选marker应能清楚反映目标片段的大小，且次要片段大小也能反映出来。如作酶切鉴定时，目的片段和切后载体片段最好能在同一个marker中反映出来，若二者不能兼顾，将前者作为主要考虑要素。 2.常见问题分析 Q：为什么marker条带非常模糊，无法辨别具体条带？ A：出现上述情况，可能有以下几个原因：1. marker条带出现了降解。请确保在使用过程中避免核酸酶污染；2. 电泳缓冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；3. 电泳条件不合适。电泳时电压应不超过20V/cm，温度应低于30℃；4. marker上样量过多。请根据说明书选用合适上样量；5. 凝胶质量不好。建议使用质量较好的琼脂糖；此外，凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。 Q：为什么marker条带出现不规则的条带（如哑铃状等）？ A：出现上述情况，多与以下几个原因有关：1. 电泳缓冲液陈旧。老化的

聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。 图 1 实时荧光扩增曲线图 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶

引子：从06年12月份开始，断断续续做了一个多月的3’RACE，有了一些心得和体会。期间看了很多前辈们分享的经验，受益匪浅。在这里，我就自己的经历略作总结，希望能给像我一样的新人们有点启示，少走些弯路，不当之处欢迎指正。 一、试剂盒的选择：3’RACE从原理上就能明白，它比5’RACE 要容易得多，所以并不一定需要用进口试剂盒。原来准备用Takara 3’RACE的试剂盒，可是看了一下它的原理和内容，觉得挺挫的，自己DIY可能效果更好一些呢。于是根据 Invitrogen GeneRacer Kit 自己DIY了，效果不错。找来了：Invitrogen的SuperScript III反转酶，TAKaRa　LA Taq酶、Pyrobest高保真酶。 并根据 Invitrogen GeneRacer Kit，自己合成了3’接头引物(侵犯了人家知识产权)： 3’接头：3'ap 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)18 -3' 54 bases 3’外侧：3'Primer 5’-GCTGTCAACGATACGCTACG

SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30 MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3' / 5‘-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。 我们在实验中发现，要做好RACE反应实验不容易，实际操作中仍存在不少困难。因

Primer Premier4.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计，评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif）。这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功能的介绍请参看Plasmid Premier2.02。 打开程序首先进入的是序列编辑参看，与Plasmid Premier相比，其多了一个语音校正的功能，即在输入序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校正，保证输入的正确和快速。 点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。 该界面共分为四层，最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑；右边是观察两个引物在模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择；第二层是显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示；第三层是显示两个引物的各种参数，包括给引物

从RNA到电泳鉴定 一、RT-PCR原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA 为模板，用VI 型胶原蛋白的α1 链的编码序列的特异性引物进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA 探针、构建RNA 高效转录系统。 1）随机六聚体引物：当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。 2）Oligo(dT)：是一种对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。由于Poly(A+

25. 用软件设计的引物为什么不管用？ 答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实， PCR 扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。 26. 为什么引物的 OD260/OD280 小于 1.5 ？ 答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是 DNA, 但是 OD260/OD280 的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好，还不听解释。撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？ 需要指出的是 OD260/OD280 的比值不能用来衡量引物的纯度。 OD260/OD280 的比值过低一般是由于引物中 C/T 的含

琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖 . 长度彼此相差 30�40bp 的多重 PCR 产物在通常使用的 SeaKem 或 NuSieve(FMC BioProducts) 3% 的琼脂糖凝胶可以很好的区分开。在低电场强度下过夜电泳可以优化每个 PCR 产物条带的电泳效果，特别是当 PCR 产物小于 400�500 bp 时。 聚丙烯酰胺凝胶 . 为了分离长度仅差几个 bp 的 PCR 产物（例如微卫星标记）需要使用浓度 6%�10% 的聚丙烯酰胺凝胶 (PAA 胶 ) 。非变性 PAA 胶可以有效的区分非多态性基因，但在这种胶上分离微卫星片断会出现不正常条带。例如在分析含有单拷贝人类第 12 号染色体的两个杂交瘤细胞系的人类第 12 号染色体上某个多态性位点时，对于每一个被检测的基因位点，在非变性 PAA 胶上都出现了两个条带 (e.g., Figure 5d) 。在常规的 6% PAA/7 M urea 测序胶上，每个被检测的基因位点都仅有一条带 ( 比较 Figure 5, d 和 e 的产物 ) 。 我们用一系列样品检测了多个参数

一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同. 多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，可组合系统的有: ①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠. ②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病. ③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断. ④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，