TILLING in the Botanical Garden final A17 published version 06.pdf Target-selected mutant screen by TILLING in Drosophila.pdf TILLING (Targetting Induced Local Lesions In Genomes) Technology for Plant Functional Genomics.pdf TILLING and ecoTILLING in cereals.pdf TILLING 技术是于上个世纪 90年代末期，美国 Fred Hutchinson癌症研究中心基础科学研究所的 Steven Henikoff领导的研究小组发展起来的（ 1） 。目前， TILLING技术作为种研究方法已经应用于多种生物中，如拟南芥、玉米、水稻、百脉根、小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫等。对于拟南芥，这一技术已经非常成功并能够实现流水线操作，大量的突变序列可以用 in silico 进行分析。 TILLING一词中文还没有统

研究蛋白质芯片的意义 1 。蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物质层面； 2 。探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理，甚至可直接利用 生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测； 3 。适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物； 4 。有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。 蛋白质芯片的分类： 1，蛋白质检测芯片 2， 蛋白质功能芯片 蛋白质芯片的制备： 1。固相载体及其处理 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片） 2。蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解 3。点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等 4。膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白 5。微阵列的封闭固定微阵列上的蛋白样点 主要封闭试剂：BSA或Gly 相关链接: 全部有关生物芯片的实验方法技术(protocol) 生物芯片相关仪器及芯片 ・芯片扫描仪 ・芯片点样仪 ・生物芯片 ・生物芯片系统

液态芯片原理 编码微球：分别用不同配比的两种荧光染料将直径5.6μm的聚苯乙烯微球（Beads）染成不同的荧光色，从而获得多达100种经荧光编码的微球。 交联探针、抗体或抗原：把针对不同检测物的核酸探针、抗体或抗原以共价方式结合到特定荧光编码的微球上。 检测反应：先把针对不同检测物的、用不同荧光色编码的微球混合，再加入被检测物（可以是血清中的抗原、抗体或酶等，也可以是PCR产物）。 悬液中的微球与被检测物特异性结合，结合物被标记上荧光物质。 激光分析：微球成单列通过两束激光，一束判定微球的荧光编码；另一束测定微球上的报告分子的荧光强度。 1）液态芯片目前仍然处于基础研究方面，虽然已经有部分临床研究，但可能离大规模应用还有一段距离。 2）常见的应用如肿瘤、内分泌、自身免疫等的检测，也有人将其用于细胞因子谱判断。 3）下面是一些液态芯片相关经典的文献，有时间参考一下 1. Hany Ezzeldin, Yoshihiro Okamoto, Martin R. Johnson, et al. A High-qhroughput

DNA 芯片的制备与应用 DNA 芯片的出现，是生物技术领域的一次革命，虽然现在无法预知它带给我们的变化。但由于它在人类基因组计划，基因表达和药物筛选等方面的潜在用途。目前已有越来越多的公司和研究机构加入到DNA芯片的设计与开发。DNA芯片技术集成了集成电路制造，照相平板印刷，DNA合成，探针的荧光标记, 激光共聚焦扫描和计算机等技术. 体现了生物学技术与其他学科和技术的相互交叉和渗透。 DNA芯片的基本原理 DNA 芯片的基本原理将不同序列的小片段DNA分子有序地排列在一块玻璃，硅或滤膜等固体载体上，以此作为生物信息的的存贮载体，运用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和处理，可以进行如基因表达分析、 基因的多态性（polymorphism）检测、DNA 测序和在基因组范围内进行基因型分析等.具有高效和高信息量的优点。荧光的检测技术包括共聚焦激光扫描和CCD 图象处理技术。即由激光共聚焦显微镜或光电倍管进行激光诱导荧光扫描，得到不同辉度的荧光图像，用杂交后的荧光强度表示核酸的量。由计算机进行数据的自动化处理和定量分析。由于DNA分子在载体上面按列和行整齐地排列，因此，DNA芯

产品详细描述 ProteinChip SELDI系统用于从大量复杂生物学样品中快速获得蛋白质分子量图谱，发现Biomarker。它使用表面增强的激光解吸离子（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization）技术来捕获、检测和测量复杂生物样品中的肽段和蛋白质的分子量。 蛋白质芯片所独特拥有的化学修饰表面使得该技术能够与其他基于分子量的分析系统相区别。SELDI技术提供了一系列进行不同表面修饰的芯片，从而获得基于芯片性质的谱图――把选择性吸附、洗脱和肽段与蛋白质分析这些步骤整合到了一个简单的平台上。复杂的生物样品，如血清、细胞裂解液等，可以直接上样到芯片表面，被不同化学修饰的芯片表面所捕获的不同蛋白质可以进入随后的飞行时间质谱分析。 SELDI蛋白质芯片系统实现了来自小样本的基于芯片的蛋白质和肽段图谱与一个能够用于高通量分析的平台的一体化。 SELDI流程 SELDI蛋白质芯片的使用包括四个步骤： 步骤一：芯片类型的选择 蛋白质芯片提供了多种色谱的功能，包括亲水、疏水、阳离子交换、阴离子交换以及金属亲和表面等

1.麻醉后将头部同定于动物实验用立体定向架卜，切开有额顶头皮，用微型钻磨去颅骨形成5ram直径大小网形骨窗 2.在手术显微镜下剪开硬脑膜，用微量注射器将10％BDA溶液(美国Molecular Probes公司产品)缓慢注入右侧的感觉运动区皮质(sensorimotor cortex)内。注射时将微量注射器同定在一 体定向支架上，选择无血管区作为注射点，每个注射点分别在距皮层表面0．5、1．0和2．0mm处各注药一次，每次剂量0.5微升 。每次注射后针头滞留10min， 然后缓慢进退针。每个动物接受10个皮层注射点，BDA注射总量为2100微升。 3.注射完毕后用薄层明胶海绵覆盖脑表面，缝合头皮。 4.2周后再次麻醉动物，打开胸腔，用4 生理盐水和4％多聚甲醛液行心脏灌注后，取出大脑和脊髓组织，置于4％多聚甲醛液中4~C保存，待处理。 BDA染色显影： 1.分别取大脑和各段脊髓组织，脊髓分别取上颈段(C )，胸段(Ts嘏)，腰段(L． )， 用冰冻切片机连续切片，组织切片厚度为40 m。 2.采用自由漂乳法将组织切片先后

　时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA）是近十年发展起来的一测微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。 　　时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析的利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度的提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。 　　解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1－2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。

应该对各官能团的特征吸收熟记于心，因为官能团特征吸收是解析谱图的基础。 对一张已经拿到手的红外谱图： （1）首先依据谱图推出化合物碳架类型：根据分子式计算不饱和度，公式： 不饱和度＝F+1+(T-O)/2 其中： F：化合价为4价的原子个数（主要是C原子）， T：化合价为3价的原子个数（主要是N原子）， O：化合价为1价的原子个数（主要是H原子）， 我以前本科上谱学导论时老师给过公式，但字母都被我改了:F、T、O分别是英文4,3，1的首字母，这样我记起来就不会忘了 ：）。 举个例子：比如苯：C6H6，不饱和度＝6+1+（0-6）/2＝4，3个双键加一个环，正好 为4个不饱和度； （2）分析3300~2800cm^-1区域C-H伸缩振动吸收；以3000 cm^-1为界:高于3000cm^-1为不 饱和碳C-H伸缩振动吸收，有可能为烯, 炔, 芳香化合物,而低于3000cm^-1一般为饱 和C-H伸缩振动吸收； （3）若在稍高于3000cm^-1有吸收,则应在 2250~1450cm^-1频区，分析不饱和碳碳键的伸 缩振动吸收特征峰，其中： 炔 2200~

红外识谱歌 红外可分远中近，中红特征指纹区， 1300来分界，注意横轴划分异。 看图要知红外仪，弄清物态液固气。 样品来源制样法，物化性能多联系。 识图先学饱和烃，三千以下看峰形。 2960、2870是甲基，2930、2850亚甲峰。 1470碳氢弯，1380甲基显。 二个甲基同一碳，1380分二半。 面内摇摆720，长链亚甲亦可辨。 烯氢伸展过三千，排除倍频和卤烷。 末端烯烃此峰强，只有一氢不明显。 化合物，又键偏，～1650会出现。 烯氢面外易变形，1000以下有强峰。 910端基氢，再有一氢990。 顺式二氢690，反式移至970； 单氢出峰820，干扰顺式难确定。 炔氢伸展三千三，峰强很大峰形尖。 三键伸展二千二，炔氢摇摆六百八。 芳烃呼吸很特征，1600～1430。 1650～2000，取代方式区分明。 900～650，面外弯曲定芳氢。 氢吸收有两峰，700和750； 四氢只有750，二氢相邻830； 间二取代出三峰，700、780，880处孤立氢。 醇酚羟基易缔合，三千三处有强峰。 C－O伸展吸收大，伯仲叔醇位不同。 10

l 样品要求： 1.经荧光探剂标记(单标、双标、三标） 2.固定的或活的组织 3.固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal专用小培养皿，盖玻片) 4.悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封 一. 组成 倒置或直立荧光显微镜、扫描头(照明针孔、探测针孔、荧光滤片系统、镜扫描系统和光电倍增管)、扫描头控制电路、计算机和图像输出设备 二. 原理 Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。 三. 激光扫描

化学发光 (ChemiLuminescence ，简称为 CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光 ( 光辐射 ) 所吸收的能量来源不同。体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。化学发光体系用化学式表示为： 依据供能反应的特点，可将化学发光分析法分为： 1 ）普通化学发光分析法 ( 供能反应为一般化学反应 ) ； 2 ）生物化学发光分析法 ( 供能反应为生物化学反应；简称 BCL) ； 3 ）电致化学发光分析法 ( 供能反应为电化学反应，简称 ECL) 等。根据测定方法该法又可分为： 1 ）直接测定 CL 分析法； 2 ）偶合反应 CL 分析法 ( 通过反应的偶合，测定体系中某一组份； 3) 时间分辨 CL 分析法 ( 即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定 )

化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤，即化学激发和发光。因此，一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：第一：反应必须提供足够的能量（ 170 ～ 300KJ ／ mol ） ，第二，这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态，并且有足够的荧光量子产率。到目前为止，所研究的化学发光反应大多为氧化还原反应，且多为液相化学发光反应。 化学发光反应的发光效率是指发光剂在反应中的发光分于数与参加反应的分子数之比。对于一般化学发光反应，值约为 10 － 6 ，较典型的发光剂，如鲁米诺，发光效率可达 0 . 01 ，发光效率大于 0 。 01 的发光反应极少见。现将几种发光效率较高的常用的发光剂及其发光机理归纳如下。 1. 鲁米诺及其衍生物 鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、 4― 氨基已基 ―N 一乙基异鲁诺及 AHEI 和 ABEI 等。鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为 425nm 的化学发光。 在通常情况下鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应相当缓慢，

（一） 原理 免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。 （二）影响免疫电镜的一些因素 1．标记物 用于电镜观察的标记物有三类：一类是电子密度致密的标记物，如铁蛋白、辣根过氧化物酶等。另一类则是放射性同位素，如135 I、35 S、32 P、14 C、3 H等，第三类则是有独特形状的标记物，如血兰蛋白、噬菌体等。 对标记物的要求是：具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状。目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和HRP。两者各有其优点，铁蛋白电子密度致密。观察时反差大，优于酶标记，但铁蛋白分子量大(460 000)，穿透能力差，所以适于细胞表面抗原的定位，另外铁蛋白

测微尺的使用: 测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一块圆形玻璃，中心刻有一尺，长5~10mm，分成50~100格。每个所代表的实际长度因不同物镜的放大率和不同镜筒长度而异。镜台测微尺是在一块载玻片的中央，用树胶封固一圆形的侧微尺，长1~2mm，分成100或200格。每格实际长度为0.01mm（10μm）。当用目镜测微尺来测量细胞的大小时，必须先用镜台测微尺核实目镜测微尺每一格所代表的实际长度。 方法如下： 1．将一侧目镜从镜筒中拔出，旋开目镜下面的部分，将目镜侧微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，重新把旋下的部分装回目镜，然后把目镜插回镜筒中。 2．将镜台侧微尺刻度向上放在镜台上夹好，使侧微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台侧微尺的分度。 3．小心移动镜台侧微尺和转动目镜侧微尺，使两尺左边的一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线。 4．纪录两条重合线间目镜侧微尺和镜台侧微尺的格数。计算目镜侧微尺每格所代表的实际长度。目镜尺每格所代表的实际长度=（两重合线间镜台测微尺的格数/两重合线间目镜测微尺的格数）×1

现象可能原因解决方案 转化后无菌落生长 感受态细胞已经失效用pUC18质粒进行转化，确认细胞的感受态效率。1ng pUC18质粒至少应得到1000个以上的转化子。如有问题，重新制备感受态细胞。 平板所用抗性不对pBS-T载体为amp抗性，工作浓度 100 ug/ml 连接中使用了不恰当的vector:insert 比例估计PCR产物的量，将vector:insert比例限制在3:1到 1:5的范围内。对于极小的PCR产物进行克隆，很可能因为PCR产物严重过量，导致无菌落或菌落极少。 白色克隆无插入片段 可能反复冻融导致载体单个的3’端突出的T已经降解 试用其他批次的T载体。 长期不用的载体请在-20℃保存，避免反复冻融载体。 做自连对照检测T载体。如果自连长出大量菌落，请放弃载体。 转化后只有白色克隆 本载体加T及连接PCR产物效率非常高，对于一些质量很好的PCR产物，有可能转化后菌落全部为白斑 平板上未涂 IPTG 或X-Gal如果平板上与空白对照相比，菌落数明显增加，则该情况很正常。 绝大部分菌落为蓝色或淡蓝色，只有极少数的白斑 有可能插入片段没有失活lacZ基因很小的插入片段

构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中

1. 试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。 3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4、常用试剂及其配方： ▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳 22.94g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠 10g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN ）法 准备工作： 1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。 2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。 3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。 试验步骤： 表3：加入试剂量据此表 Total RNA RNase-free Water to: Buffer OBB (ul) Oligotex Suspension (ul) Prep size <=0.25mg 250ul 250ul

1 ． pBlueScriptII 的提取 1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。 2．第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。 3．第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6 hr左右，使OD值达到0.6-0.8。 4．将菌液移入250ml离心管中， 4℃，3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。（注意离心前需配平） 5．加入10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加入RNase至终浓度100µg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。 6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，静置3-5min。 注： 静置时间

1 ．电转化感受态细胞的制备 1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照） 2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。 3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。 5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。 6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。 8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10