前期记录先确定目标基因CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 确定目标基因然后对目的基因进行背景调查CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 目的基因背景调查设计 sgRNA 及引物CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- sgRNA 及引物设计补充上次推文我针对 sgRNA 设计方面增加了一部分内容，有一位特别棒的读者（简书名：chuxinxzz）在下方留言说可以使用 Cas9 +sgRNA 切割效率试剂盒验证切割效率，并且经实践得知，验证结果和实际编辑结果相差无几。感谢他给我的补充，这也是我写下去的动力，毕竟我一个人的精力是有限的，因此不论我好与坏，我都先把自己拎出来，以期待得到其他人的交流和答复，从而学到更多的经验。昨天和今天昨天我依照 golden gate assembly 的方法，参照了张峰老师实验室 protocol，使用了 BbsI 限制性内切酶和 T4 连接酶，将合成好的 sgRNA 插入到带有 Cas9 的质粒中；接着转化到感受态细胞中--复苏感受态细胞后--涂氨苄西林平板过夜培养--今天傍晚挑取单克隆菌落置于氨苄西林+LB 培养基中过夜培养，明日即可提取质

前期记录CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 确定目标基因CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 目标基因背景调查CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- sgRNA 及引物设计CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 构建 sgRNA+Cas9 载体golden gate 构建好载体，酶切验证成功293FT 细胞转染验证1. sgRNA+pSpCas9 载体用 lipofectamine 3000 转染至 293FT 细胞（按照转染试剂的说明书走），确保转染效率> 70%；2. 72 h 后收集细胞提取基因组 DNA（按照基因组 DNA 提取试剂盒的说明书操作）；3. 使用事先设计好的引物进行 PCR 扩增，这里使用的酶是 NEB 公司的 Q5 high-fidelity Polymerase，一切按照该酶的说明书严格操作；4. 将目的条带切割下来并使用胶回收试剂盒回收 DNA 条带，一切按照胶回收试剂盒说明书进行操作；5. 回收后的 DNA 样本，经 T7 Endonuclease I 酶解验证错配 DNA，部分结果如下：T7 EI验证成功，开始正式实验时间飞逝

关于 OneNote 笔记，估计大多数都不陌生，如果你的电脑是微软系统，只要安装了 office 软件，系统会自带 OneNote。如果你的电脑里还没有 OneNote，可以到官网进行下载。下载网址：https://products.office.com/zh-CN/onenote1. 最像笔记本的笔记软件OneNote 简直就是一本普通笔记本或三孔活页夹，可以在页面的任一角落进行输入，文字、图像、手写，全部包括。2. 树形目录OneNote 是由笔记本-> 分区组-> 分区-> 页-> 子页组成，可以让你的笔记本管理非常系统，就像一本书一样，层次分明。我的笔记本共建立了三个分区组：Home、School 、Work，然后根据自己的需求在相应的分区组里再建立不同的分区和页码。3. 不限格式，形式多样由于阅读材料是 PDF 格式的文件，可以将文本「插入为附件」或「插入 PDF 打印输出」直接在笔记本中进行记录。除了 PDF 格式，其他比如格式：照片，Word，PPT，Excel 等都可以这样使用。4. 便捷查找功能大家可能都有这种经历，一个知识点虽然学了但是还没有

如果你已经开始使用 OneNote，一定会对它的自由排版和云端同步印象深刻。既能随手记录日常待办事项，也可以拼贴各类素材完成一次项目方案，OneNote 的好处真的不少。今天就来学一学它的进阶技巧吧！图片秒转文字一张图片转文字要多久？你：「得看文字长度和打字速度。」不不不～在 OneNote 统统只要 1 秒。点击「文件」➔「图片」，选择需要导入的图片。右击图片，选择「复制图片中的文本」。再于空白处粘贴，文字就单独复制了出来。基于图片质量和字体原因，图片中的文字不一定能全部识别。只需要再简单校正一下就能搞定，比起你慢慢打字效率可是高了不少！不仅如此，你还能直接将其复制到其他 Office 应用中。神奇的文字拖拽OneNote 就像一张真正的白纸，你可以随意在任何位置添加文字与图片。如果你想要调整一行文字的位置，只需要将鼠标移动到正文左方的开头处，出现一个灰色箭头的图标后，按住它就可以进行拖拽，而不需要反复的复制粘贴。如果你创建了某个项目清单，只需要直接拖拽就能改变上下次序，轻轻松松整理各类图文素材。创建待办事项OneNote 内建了很多基本的标签。例如待办事项□、重要⭐️、问题❓等等。

今天讲讲如何用 Graphpad Prism 5 制作生存曲线，摆脱用 EXCEL 和 PPT 做图的习惯。生存曲线图我们经常能在文献中看到，如下图是一篇在新英格兰杂志中的一个生存图，好像是 EXCEL 是无能为力了吧。也许你会说，SPSS 也能做，但我觉得没 Graphpad Prism 做起来的图好看。好，废话不多说，进入正题。1. 打开 Graphpad Prism5，点击 FILE>NEW>NEW PROJECT FILE，或者如下图，都可以打开建立一个新的 FILE。2. 然后会弹出如下图的界面，按照我所圈选的标记后，点击 CREATE。3. 在左边 DATA TABLES 下会出现个 DATA 1，你可以在这右击鼠标改名 RENAME FILE。按照要求输入下面数值。第一列是时间，我要做的是月份，所以用 MONTHS。第二列和第三列分别是标准组和实验组的结果，当然你也可以设置为 A 和 B 组等等，可以看出里面不是 1 就是 0，其中 1 代表发生，0 代表未发生。举个例子，如果是做总体生存期 OS 的话，1 就是死亡，0 就是存活了。其中要注意的就是标准组和实

BMC医学正在寻求提供干细胞治疗的新转化和临床见解的原始研究报告，作为正在进行的干细胞系列的一部分。这个主题系列将有自己专门的网页，我们的目标是突出一些最重要和最热门的问题——包括干细胞研究的最新进展、争议和挑战，当然还有它们的临床意义。为了开始这个系列，三篇特别委托的BMC医学文章强调了临床干细胞研究中一些最重要和最热门的问题。Hans Snoeck在给转化研究人员的“战斗召唤”中描述了将人类多能干细胞分化为胸腺上皮细胞的潜力，这种潜力目前还未被发现。Marios Politis讨论了一种优化的功能成像方案如何帮助帕金森病胎儿细胞移植的新临床试验。Alan Trounson对目前正在进行的所有试图将干细胞疗法用于患者的临床试验进行了概述。此外，生物医学中心的三家旗舰期刊已经联合出版了一份关于干细胞生物学和医学的评论和评论文章的宣传刊物，6月份在多伦多召开的ISSCR会议上可以在生物医学中心的展台上看到。如果你是来参加会议的，我们鼓励你顺便去拿一份期刊，里面有BMC医学、BMC生物学和基因组医学的贡献。如果你希望你的研究在BMC Medicine上被考虑，请发送预先提交询问到bmcme

干细胞龛的概念——作为多能干细胞的微环境——是一个古老的概念，但随着识别干细胞和可视化生态位的工具的进步，这一概念也在不断发展。在为BMC生物学的一篇新论坛文章中，来自不同领域的八名专家讨论了干细胞生态位的定义以及他们正在研究的生态位的重要意义。讨论的领域包括完善线虫生殖系细胞利基(Judith金布尔),皮肤越“古典”领域(Elaine Fuchs)和肠道(Hans聪明),壁龛的肌肉(迪迪埃Montarras和玛格丽特•白金汉),神经元(Anne Calof)和骨髓(Andreas Trumpp),以及最近描述适合转移/癌症干细胞(Thordur Oskarsson)。我们的专家描述了每个生态位是如何形成并突出其独特的特征的，例如，是什么触发了干细胞离开其静止状态(从损伤到各种信号通路的激活)，以及细胞外基质是如何影响生态位的。讨论的领域包括完善线虫生殖系细胞利基(Judith金布尔),皮肤越“古典”领域(Elaine Fuchs)和肠道(Hans Clevers),壁龛的肌肉(迪迪埃Montarras和玛格丽特•白金汉),神经元(Anne Calof)和骨髓(Andreas Trum

这篇最新的《基因组医学》社论由客座编辑Stuart Orkin (Dana-Farber癌症研究所)撰写，这是该杂志自2009年创刊以来发表的第250篇文章。这篇发表在6月号上的社论为一系列关于干细胞基因组学的新主题文章奠定了基础。本系列旨在通过特别委托的评论和评论文章，突出这一不断发展的领域中基础和翻译研究的关键进展。Stuart Orkin通过讨论干细胞基因组学和细胞重编程的最新进展来介绍本系列，并预测未来可能出现的新见解和治疗策略。作为该系列文章的开篇，斯坦福大学的Joanna Wysocka回顾了使人类多能干细胞的表观基因组图谱得以实现的技术进步，并讨论了这些发现将如何提高我们对复杂疾病的认识。玛丽·马吉姆德(贝勒医学院)在制定干细胞和基因组学领域的研究政策时，思考着共同的主题和关注的领域。《基因组医学》六月号还刊登了乔治·戴利(波士顿儿童医院)关于基于微rna的细胞重编程的研究重点。不久之后，Lawrence Goldstein(加州大学圣地亚哥分校)发表了一篇关于诱导多能干细胞对阿尔茨海默病建模能力的综述，Gordon Weir(哈佛干细胞研究所)发表了一篇关于干细胞方法对

Adobe illustrator 是一种应用于出版、多媒体和在线图像的工业标准矢量插画的软件，是一款非常好的图片处理工具，简称 AI。作为一只实验狗，总要想办法展示自己的数据结果，漂亮的配图则会给你的文章锦上添花。AI 都是可以处理科研用图的神器，不管是示意图模式图、信号转导通路图、通过 R 或者数据处理软件得到的生图，还是需要后期排版的图表，用 AI 都可以分分钟搞定。而且对于科研绘图而言，AI 中复杂的功能也用不到，掌握最基础的工具和方法就足够了，所以希望大家通过这一系列教程，学会用 AI 绘制和处理各种论文绘图。本节我们先通过绘制下面这个简单的磷脂双分子层、DNA 双螺旋结构等示意图，来了解一下最基本的元素绘制和工具使用。基本操作会了，再配合后面的素材就可以快速拼装出高质量的模式图了。界面和画板设置AI 的基本界面如下图所示，上方菜单栏、左侧工具箱、右侧控制面板包括了所有我们需要用到的工具。从上方菜单栏中，选择文件菜单，新建文件，可以对新文件的页面进行设置。在画板区域单击鼠标右键可以调出标尺和网格线背景。从标尺向下或向右拖拽，可以调出参考线，右键锁定参考线。参考线可用于设置页边

经过多个转换器综合测评后终于发现了一个免费的、功能强悍且稳定的 PDF 转换工具--Solid Converter v9，墙裂推荐给大家。一、Solid Converter v9 软件安装① 下载完成后，双击安装；② 安装过程很简单，这里就不详细说明了；③ 安装完成后，打开软件，将会提示你是试用还是购买软件，这时候选择「我已有解码密码」④选择「解锁密码」后，直接复制以下信息填写以下账号信息即可。名称：SolidConverterPDFv9电子邮件：Solid@Converterv9@ukr.net机构名称：SolidConverterv9解锁密码：KFMK填写完成后就可以使用了！二、Solid Converter v9 特色功能1. 无需安装 Word、Excel、PowerPoint 即可将 PDF 转 Word、 转 Excel 、 转 PowerPoint;2. 将多个 PDF 表格合并为一个 Excel 表单; 从 PDF 文件中将数据提取为 .CSV 文件;TIFF 至 PDF 转换器；3. 将 PDF 文件内容导出为任何可支持的格式转换（Word、Ppt、Excel、HT

正在准备国自然的朋友都知道，申请国自然课题过程中困难重重，最让人头疼的就是标书应该怎么写？小编今天要与大家分享如何从顶级 SCI 论文中获取基金标书撰写思路的方法，正在写标书或者是准备要写标书的小伙伴都可以看一看～一、基金标书撰写套路1、框架思维先理清思路！做好框架！再动笔！科学假说的提出思路：2、写作「套路」：「7 + 6」7 个核心问题：要解决的临床问题是什么？为解决这个临床问题，别人做了什么科学研究？别人的科学研究中，有哪些是没有解决的科学问题？为了解决这些科学问题，我们做了什么前期研究？我们的前期研究中，有哪些需要进一步探索？我们的科学假说是什么？为了验证假说并解决问题，我们打算做什么项目内容？6 个主要模块：提出临床问题聚焦科学问题引入研究对象提出科学假说前期研究基础概括研究内容二、从顶级 SCI 中获取撰写思路案例：1、文章题目N6 -Methyladenosine modification of lincRNA 1281 is critically required for mESC differentiation potential.来源：Nucleic Acids R

在Western blot、IHC/ICC/IF、ELISA/FACS（表位）/Co-IP、ChIP等这些实验中，都需要用到抗体，但是抗体市场的庞杂带来了质量的参差不齐，抗体的不可靠性也会给科研带来巨大损失，包括时间和资源上的浪费。2006年耶鲁大学病理学家David Rimm研究了一项有效治疗黑色素瘤皮肤癌的指导方法，这项技术的基础是抗体——可以结合成为特殊生物学分子的Y形大蛋白，而且可以在样本中标志它们的存在。而当他准备好资金来将这种检测推广到临床时，他的团队从同一家公司订购的新的同一批次的抗体（可以认为性质是相同的）却无法重现原始的研究成果，难以产生同样的染色模式！Rimm被迫放弃自己关于黑色素瘤抗体疗法的研究。与其事后懊悔，研究者们还是应该投入多一点精力在抗体选择上。今天推荐几个抗体选择网站，抗体真假不用担心，一查便知！1、CiteAbhttps://www.citeab.com/CiteAb是全球最大的抗体搜索引擎，所有产品的搜索结果严格按照文献引用数目进行排名，抗体供货商无法用付费来提升排名。目前该平台收录了来自全球的192家抗体供应商、超过400万种抗体、165+万余篇

如果给你一张静态的染色图，你可能觉得 so easy，老板再也不用担心我没有统计结果了。如果给你一个动画，你会不会傻眼了呢？看着攀爬的细胞，你脑子里闪过高中物理知识，这个细胞迁移长度，位移，速率，轨迹都是重要的参数啊，可是怎么统计呢？定性的说明不再被买账，而定量的统计结果成为刚需。今天向大家介绍一个有用的软件「Imaris」，可以自动统计细胞动态迁移图中细胞迁移的各种参数。具体操作如下1. 在 Imaris 中点击「open」，点击一下（选中）你导出的 tiff 文件中的一个。注：Imaris 支持几个大型厂商如 Zeiss，Olympus，Lica 显微镜系统默认的文件格式，如果你使用的不是这些，你可以将拍摄的系列图片转化为系列命名的 tiff 文件供 Imaris 软件打开。2. 点击界面下方的「Settings」按钮，在弹出的界面将 tiff 后面的下拉框选项选为「T」，图像就变为 T1 -T6 的系列时间轴的图片。3. 点击「OK」键后，界面回到前一个「Open file」界面，再点击「open」按钮即可。4. 打开的图片呈现出六个时间点（如上图红色箭头所示）。这表示系统已经认

作为一个爱看文献的科研狗，不能下到想看的文献一直是一件很头疼的事情，好在我们一直有 Sci-hub 这个神器，导师再也不用担心我们看不到文献了。但是…...Sci-hub 经常会打不开，打不开，打不开~那我们应该如何是好呢？这不，实验菌今天又给大家寻觅了一个神器~科睿唯安大家想必都很了解，就一个字，牛！科睿唯安（ClarivateAnalytics）是全球专业信息提供与分析服务领域的领导者。科睿唯安旗下拥有诸多业界知名品牌，包括 Web of ScienceTM 平台（含科学引文索引，即 Science Citation IndexTM，简称 SCI）、InCitesTM 平台、Derwent InnovationTM 平台、德温特世界专利索引（Derwent World Patents IndexTM，简称 DWPI）、CortellisTM、CompuMarkTM、MarkMonitor® 以及 TechstreetTM 国际标准数据库等。那 Kopernio 又是啥？Kopernio 是一家位于伦敦的初创公司，由 Mendeley 和 Newsflo 的创始人于 2017 年创建

① PNAS 揭示生长素调控细胞分裂模式新机制细胞分裂模式在器官的形成过程中发挥着至关重要的作用。在植物中，生长素作为最重要的激素之一已经被报道在器官发育过程中调控细胞的分裂模式，然而细胞分裂模式如何在时空上被生长素精确调控仍然知之甚少。福建农林大学海峡联合研究院徐通达课题组报道了非经典的植物生长素信号通过类受体蛋白激酶 Transmembrane kinases (TMKs) 调控侧根发育过程中细胞分裂模式的分子机制。研究发现拟南芥 TMK 家族中的两个成员 TMK1 和 TMK4 介导了生长素对于细胞分裂模式的调控，最终决定了器官的形成和发育过程。研究人员发现，TMK1 和 TMK4 功能缺失的双突变体表现出严重的侧根发育缺陷且对生长素处理不敏感，在细胞水平上表现为侧根原基细胞分裂模式严重紊乱。这一研究建立了生长素信号与 MAPK 信号通路的联系，阐明了植物生长素信号传导途径在非转录水平上调控细胞分裂模式的新机制。该工作为研究植物激素信号如何调控细胞分裂方向的改变拓展了新的思路。原文检索：Noncanonical auxin signaling regulates cell div

干细胞研究与治疗邀请提交原始研究手稿，已纳入一个关于亚太地区干细胞研究的特别系列，于2012年出版。该系列丛书由台湾阳明大学的Oscar Lee、美国南加州大学的Shi Songtao、中国卫生科学研究所的Shi Yufang和Ying Jin编辑，旨在展示在该领域开展的广泛和创新的工作。开放获取的研究文章将与一系列由该领域的领导人撰写的评论和观点文章一起发表，这些领导人包括康庆新(Kyung-Sun Kang)、郭泓志(Hung-Chih Kuo)和郑明浩(Minghao Zheng)。《干细胞研究与治疗》由Rocky S Tuan和Timothy O 'Brien编辑，出版干细胞治疗的基础、转化和临床研究，包括动物模型和临床试验。该杂志对干细胞在药物发现和测试、干细胞制造和生物材料中的应用特别感兴趣。更多信息可以在我们的about页面找到。如需查询研究的适宜性，请发邮件至editorial@stemcellres.com。

BioMed Central上周参加了剑桥神经干细胞研讨会。这次会议是由剑桥干细胞计划联合主办的，旨在集中关注神经干细胞生物学领域的最新进展，并鼓励近300名代表之间的进一步合作和互动。这次会议收集暴露了在神经发生领域发现的加速步伐，特别是在正常成年人中，以及在疾病中生长和分化缺陷的作用。生物医学中心的旗舰期刊《BMC生物学》、《BMC医学》和《基因组医学》最近出版了干细胞主题系列，与会者对此非常感兴趣。格尔德•克佩尔曼(Gerd Kemperman)在开幕式上发表了热情洋溢的讲话，他回顾了令人信服的证据，证明了运动对海马神经元生长的影响。《神经发展》杂志的几位知名编辑委员会成员，包括乔纳斯·弗里斯恩、阿图罗·阿尔瓦雷斯-布伊拉、安德里亚·布兰德和弗朗索瓦·吉耶莫特，以及会议的共同组织者比尔·哈里斯(总编)在内，都是阵容强大的演讲者。全体会议还由神经发育委员会成员Fiona Doetsch(干细胞生物学、细胞规范与分化)和Fred ' Rusty ' Gage主持。在随后的会议上，Fred展示了一项令人兴奋的新工作，该工作表明，将LINE-1反转座子“跳跃基因”插入成人大脑，会导致神经

① Nature 子刊揭示控制自身免疫反应的分子机制近日，一项刊登在国际杂志 Nature Immunology 上的研究报告中，来自维也纳生物中心的科学家们通过研究分析了沉默或唤醒自体反应 B 细胞的两种拮抗机制，这两种机制受到了 Ikaros 蛋白的控制，因此其能够控制自身免疫力。当小鼠成熟的 B 细胞中缺少 Ikaros 时，研究者就能观察到较高级别的自身免疫力，这就促使他们开始研究两种开启或关闭 B 细胞的特殊机制，B 细胞抗原受体（BCR）的无效应性是一种特殊的耐受机制，其能使得自体反应性的 B 细胞对自身抗原不再敏感，同时还能促进 Toll 样受体（TLR）信号唤醒 B 细胞。本研究为科学家们阐明自身免疫疾病的发生提供了基础机制及新的线索，后期他们还会继续深入研究来开发多种能有效治疗自身免疫性疾病的新型疗法。原文检索：Ikaros prevents autoimmunity by controlling anergy and Toll-like receptor signaling in B cells ② 中科院构建了可变形的多级次纳米药物递送系统10 月 2 日，Sci

为什么考虑干细胞的个体性很重要?数学方程能预测什么时候干细胞突变会导致潜在的致命疾病吗?多能干细胞会成为未来的疾病模型、推动药物发现和预测副作用吗?这是生物医学中心的三家旗舰期刊(BMC生物学、BMC医学和基因组医学)最近在《BMC生物学》杂志上发表的干细胞专题系列文章中讨论的一些问题。作为开场白，《BMC生物学》系列丛书的咨询编辑Arthur Lander评论说，目前干细胞生物学的概念可能没有考虑到“干细胞的个体性”中单个干细胞的可塑性和多样性的含义。David Dingli和Jorge Pacheco在一篇名为《随机动力学与干细胞突变的进化》的观点文章中，以慢性髓系白血病和阵发性夜间血红蛋白尿为例，讨论了干细胞中的随机效应如何导致临床疾病。在为该系列撰写的第三篇综述文章中，Lee Rubin和Kelly Haston在《干细胞生物学与药物发现》中调查了在疾病建模中重编程的成人多能细胞的最新研究，讨论了心血管疾病和神经系统疾病的临床意义。有了这些和未来对这个系列的贡献，我们希望刺激跨学科的合作努力，以进一步了解干细胞的生物学。请继续关注本系列的其他内容。

自从 CRISPR 基因组编辑技术问世以来，它已经显示出了治疗许多棘手疾病的巨大希望。然而，科学家们一直在努力确定与治疗有关的细胞类型的潜在非靶向效应，这仍然是临床转化的主要障碍。现在，Gladstone 研究所和创新基因组学研究所（IGI）的一组科学家与 AstraZeneca 合作开发了一种可靠的方法来实现这一点。CRISPR 通过在特定位置切割 DNA 来编辑一个人的基因组。挑战在于确保该工具不会在 DNA 上的其他地方进行切割，即所谓的「脱靶效应」，可能会产生不可预见的后果。《Science》杂志的一项研究，两位第一作者，Beeke Wienert 和 Stacia Wyman，找到了解决这个问题的新方法。「当 CRISPR 切割时，DNA 就会断裂，」Wienert 博士说，他之前在 Jacob E.Corn 的 IGI 实验室工作，现在是 Gladstone 研究所 Bruce R.Conklin 实验室的博士后学者。「因此，为了生存，细胞招募了许多不同的 DNA 修复因子到基因组中的特定位置来修复断裂，并将切割端重新连接在一起。我们认为，如果我们能找到这些 DNA 修复因