大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因

本文根据自身实验经验总结，针对 PCR 实验过程出现的问题举例，提供可实施的解决方法。并根据经验列举了提高 PCR 反应特异性的方法。问题 1：假阴性（无扩增产物）现象：正对照有条带，样品无条带可能原因：· 模板：含有?Taq 酶抑制剂、杂蛋白，模板上样量低或模板降解· 引物：引物降解，引物设计不合理· 试剂：酶失活，buffer 不合适· 反应条件：退火温度高，延伸时间短解决方法：· 纯化模板并重新提取，并检测模板是否含有抑制剂· 重新设计引物并低温保存· 优化 buffer，摸索镁离子浓度或适当加入 DMSO（小于 0.3%）· 提高退火温度，增加延伸时间（反应条件参照试剂盒说明书）问题 2：假阳性现象：空白对照出现条带可能原因：· 引物设计不适，与目的序列具有同源性· 试剂污染：水、移液枪等被核酸污染· 样品间出现交叉污染解决方法：· 实验仪器高压灭菌· 实验试剂（酶除外）高压灭菌，离心管枪头一次性使用· 规范实验操作· 假阳性可通过巢式 PCR 解决，或者使用特异性较高的试剂盒扩增问题 3：拖尾、弥散现象：电泳出现拖尾、涂抹带可能原因：· 酶用量过多· 模板纯度较低· dNTP

主要可以归结为以下 6 种： （1）扩增曲线不光滑 主要有两个原因： 一是扩增信号太弱，经系统矫正后，就产生这样抖啊抖的线，小编建议大家提高模板浓度重复实验。二是仪器本身的问题，可能在扩增过程中仪器出现了波动或者本身该检测孔出现了异常。 （2）扩增曲线断裂或下滑 比较典型的曲线下滑如上图所示，主要原因是模板浓度太高了，在基线期内就起峰了，仪器会默认起峰的线条仍为基线部分，将扩增曲线往基线位置下拉，因此你的曲线就趴下来啦～这种情况大家也不要慌，可以减小基线终点（例如基线期默认 3 - 15 个循环，改为 3 - 10 个循环），重新分析数据，一般都能得到一个比较好的结果。 （3）个别扩增曲线骤降这是比较常见的一个问题，反应管内若留有气泡，温度升高后会导致气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低。所以大家进行扩增反应之前，一定要仔细检查反应管内是否有气泡残留。 （4）扩增曲线呈锯齿状且不连续 这个可以参考上图，这是典型的 ROX 添加不当导致的异常结果，曲线杂乱。大家首先可以尝试去掉 ROX 分析数据，看一下重复性是否 OK（复孔间 STD<0.2），如果还是不行，只能下次实验的

一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤:细菌培养物的生长。细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化。(一)细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体(如pUC系列)都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR322-类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。(二)细菌的收获和裂解细菌的收获可通过

一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：①． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上

蛋白质翻译后修饰 (Protein translational modifications，PTMs) 通过功能基团或蛋白质的共价添加、调节亚基的蛋白水解切割或整个蛋白质的降解来增加蛋白质组的功能多样性。这些修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂质化和蛋白水解，几乎影响正常细胞生物学和发病机制的所有方面。因此，识别和理解 PTM 在细胞生物学和疾病治疗和预防的研究中至关重要。 看到一篇 Thermo Fisher的文章，关于翻译后修饰Post-Translational Modifications (PTMs)，分享在这儿，原文是英文，值得收藏和学习哦！文末也有PTMs的一些数据库分享！Introduction：在过去的几十年里，科学家们发现人类蛋白质组比人类基因组要复杂得多。虽然估计人类基因组由 20,000 至 25,000 个基因组成，但人类蛋白质组中的蛋白质总数估计超过 100 万个。这些估计证明单基因编码多个蛋白。基因组重组、选择性启动子处的转录起始、差异转录终止和转录本的选择性剪接是由单个基因产生不同 mRNA 转录本的机制。蛋白质翻译后

为探究生物进程的分子机制，需要确定介导这个过程的蛋白质-蛋白质间的相互作用。研究蛋白质间相互作用的主要技术总结如下：一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛

Aebersold和其合作者开发了一种同时对蛋白质组进行鉴定和相对定量的方法，即一种包含在无胶蛋白质组流程中的同位素标记技术(Gygi等，1999)。他们提出使用一种试剂，这种试剂能够使两种同位素在形式上具有明显的区别，即同位素标记的亲和标签(isotopicallycodedaffinitytag，ICAT)试剂。ICAT试剂的结构包含一个生物素头部、一个连接部分和一个碘激活的羰基基团，这个羰基基团能够特异性地与半胱氨酸侧链反应。重同位素的形态与轻同位素的形态的差别相当于在连接区部分的8个氢原子被8个氘原子取代。这种方法的设计目的是比较一对生物样品。两个蛋白质样品(细胞状态I和细胞状态Ⅱ)分别单独用d0 ―ICAT和d8 ―ICAT试剂标记，然后混合，并用胰蛋白酶水解。然后将肽混合物送至生物素―亲和色谱柱分析。这一步骤通过分离和对含半胱氨酸残基肽的洗脱来完成对肽混合物的简化。洗脱步骤与能够进行质谱和串联质谱的仪器偶联。一对不同标记的肽几乎在相同的时间洗脱，可以通过两个距离为8kDa的质谱信号识别出来。因为预计d0 修饰的肽和d8 修饰的肽的电离性质是相同的，所以在每一个肽上都可以完成

相关专题蛋白质组蛋白质组（proteome）一词是澳大利亚科学家Williams和Wilkins于1994年首先提出的，它是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质总和，是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体。短短20年间，蛋白质组的研究取得了惊人的进展，这相当程度上要归功于质谱技术在蛋白质组中的应用和不断发展。同时，蛋白质组和基因组的发展是相辅相成的，凡是经过基因组测序的物种，都可以用质谱技术大规模鉴定其蛋白质组成。当前，比较主流的蛋白质组学研究方案当属LC-MS/MS系统， LC-MS/MS系统使一次实验鉴定上万个蛋白成为可能。基于LC-MS/MS系统方案也叫shot-gun法，质谱的采集模式为DDA（Data Dependent Acquisition）。在这种模式下，质谱根据离子化的肽段母离子的强度，依次选择10到20个强度最大的离子进入串联质谱，进行进一步碎裂，然后经过与模板蛋白质数据库比较确认。这种方法无疑丢失了大量有用的肽段母离子信息。此外，经过二级碎裂的二级谱图，在后期使用软件鉴定中也仅有少量谱图得到解析（约30%），大部分谱图依然得不到有效利用。由于质谱选择离子

表达分析、分子生物学研究以及新的分析软件工具将会推进生物系统水平的研究。文/EricChan西雅图RosettaBiosoftware数据分析师译/李亚萍在基因表达研究中，广泛的基因分析可以对生理状态或者是一个细胞表型有关的基因进行系统监测。可以利用高通量分析在数据输出和获取数据快捷两方面的优势，对药物发现过程中的药靶候选基因进行鉴定，在假设驱动的研究中，该技术也提供了必须的系统背景知识。一旦微阵列技术成熟，研究人员就能进行转录组研究，寻找感兴趣的标记基因。正如肿瘤基因表达对各种来源的组织和患者存活结果的相关性分析例子一样，通过微阵列技术进行的基因表达分析研究将在生物标记发现过程中继续扮演重要作用。尽管微阵列的分析能力很强大，转录组学研究平台只包括那些适应生长条件变化细胞的转录物。大多数细胞内和细胞间的生物化学过程都会受到蛋白质-蛋白质或者其他蛋白质-底物相互作用的影响。蛋白质组水平的基因表达分析提供了一个快速的可控制生物合成的快照过程，其中大部分是由转录组学平台调控的。同时，转录组本身通过表达的蛋白质或者是细胞生化状态下其他的变化，进行反馈控制。换句话说，基因表达不仅仅是从转录组到蛋

1 背景和意义从生命活动的直接执行者——蛋白质的角度研究生命现象和规律（特别是疾病防治和病理研究）已成为研究生命科学的主要手段。而这些研究往往离不开对细胞、组织或器官中含有蛋白质种类和表达量的研究。对处不同时期、不同条件下蛋白质表达水平变化的研究，识别功能模块和路径，监控疾病的生物标志物，这些研究都需要对蛋白质进行鉴定和定量。生物质谱技术的出现和不断成熟为蛋白质差异表达分析提供了更可靠、动态范围更广的研究手段。基于质谱技术，科学家们不断开发出新的定量蛋白质组学方法，来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。2 方法学介绍目前较主流的定量蛋白质组学方法有5种，分别是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、和SWATH。简述如下：2.1 Label-freeLabel-free定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。Label-free定量不需要标记处理，操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但

1994年，Marc Wilkins在Siena双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）会议上最早提出了蛋白质组（proteome）概念，并于1995年7月的Electrophoresis杂志上发表。随着高通量、高灵敏度、高分辨率生物质谱技术的出现，蛋白质组学技术取得飞速发展，人们不再满足于对一个细胞或组织的蛋白质进行定性研究，而是着眼于蛋白质量的研究，于是蛋白质组学概念就被提出，并得到了广泛的应用。蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质（protein）与 基因组学（genomics）两个词的组合体，表示“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学研究，就是要把一个基因组表达的绝大多数蛋白质或一个复杂的混合体系中绝大多数蛋白质进行精确的定量和鉴定。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学是一门以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平对疾病

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的qPCR实验，也看了很多的资料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。 我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）； 然后，将每一组样本每一个目的基因的△Ct都算好，整理进Excel，用本次实验中待研究样本的△Ct减去对照组样本的△Ct，并同时对所有结果取相反数（就是加一个负运算，正数就变成负数，负数就变成正数），该步运算得到的结果就是-△△Ct。 最后，对-△△Ct进行2的幂运算，即2^-△△Ct就得出Fold Change。 但是，我想说的是2^-△△Ct得出的是Fold Change，不仅数据结果看上去不直观反应实验组与对照组目的基因mRNA的情况，同时还具有放大效应，所谓放大就是本来A基因的-△△Ct得到为2，B

1.4. 2－△△CT方法的数据分析实时定量PCR所得到CT值可以很容易的输出到表格程序如Microsoft Excel中去。为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。通过β-actin 均一化处理，我们对目标基因fos-glo-myc 的表达变化进行了监测。在8h 的时间范围内，在每一时间点都取3 个重复样本，每一样本在cDNA 合成之後都做定量PCR ，数据分析用到了公式9，即：Time x 表示任意时间点，Time 0表示经β -actin 校正后1 倍量的目标基因表达。0 时刻目标基因和内标基因的平均CT（见图2 第8 栏）被用于公式9 中。通过公式9 计算出每一个样本目标基因表达通过β -actin 均一化处理後相对于0 时刻的倍数（见图2 第9 栏）。平均SD，CV 由每一个时间点所取的三个重复样求得。用这种分析方法，在0 时刻的平均倍数变化接近于1。我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为1 可以很方便的验证三个重复样品之间是否有错误或者误差。如果得到的结果与1偏差很大，则表明存在计算错误或者是很高的实验误差。在前面的例子中，在每一

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。5. 每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检

细胞培养的倍增是培养物中细胞总数加倍，通常是指细胞指数或对数生长期。细胞培养的代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。

肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（一）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。（二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基

1．取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5～1平方厘米小块。2．EDTA 处理：先置入0.02％EDTA中室温置5分钟。3．冷消化：换入0.25％胰蛋白酶中，置4℃过夜。4．分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。5．温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30～60分钟。6．用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。7．培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。

1 实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响.细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁,空气清新,干燥和无烟尘. 细胞培养 室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室.2 常用设施及设备(1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式,直流式和外流式三大类.(2)无菌操作间:一般由更衣间,缓冲间和操作间三部分组成.操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等.缓冲间可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等.(3)操作间:普通培养箱,离心机,水浴锅,定时钟,普通天平及日常分析处理物(4)洗刷消毒间:烤箱,消毒锅,蒸馏水处理器及酸缸等.(5)分析间:显微镜,计算机及打印机等.3 培养器皿常用 细胞培养 器皿有培养瓶,培养板,培养皿等.常准备量是使用量的三倍.器皿应选择透明度好,无毒,利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.常用的器皿有下面几种.(1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液,血清等液体,常用规格

细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。下面我们就简单明了地介绍流式在检测凋亡方面的应用。在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f-1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，可以采用以下检测方法：1、线粒体功能2、DNA Cycle3、Caspases4、Annexin V Assay5、DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，