PCR 是分子生物学科研人员必做的实验，为了扩增目的基因，经常要对 PCR 的体系进行“摸条件”，特别是一些 GC 含量高的目的基因或者 DNA 纯度不高的样本! “摸条件”成为 PCR 实验最费时费力的工作！ 虽然市场上有很多 PCR 的 MasterMix 试剂，将酶、dNTP、反应缓冲液混合在一起，很方便客户的使用，但仅仅是简单的混合，极少公司对MIX的应用范围进行广泛的实验和优化，只能做一些不复杂的 PCR。 百泰克通过长时间、无数次的实验优化，终于推出了适用范围广、稳定性良好的PCRMIX，是目前最“傻瓜”的 PCR 反应体系之一，不论是质粒、菌液、CDNA、基因组 DNA、或者是直接裂解的粗提物，GC 含量高达 75% 的模板，都能轻松扩增，不需要费力的“摸条件”！ 本产品包含酶、dNTP、特殊稳定剂和优化的反应缓冲液，浓度为 2x。DNA 扩增时，只需加入模板，引物和水，使 MasterMix 溶液的浓度为 1× 即可进行反应。具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。进行 PCR 扩增可以减少操作时间，避免因多步操作带来的污染，特别适宜高通量筛选基因的扩增 ,Taq

目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速，并受到了此次诺贝尔奖评审委员会 < language=Java1.1 src="/newsf/js/inpic.js">的青睐，获得2006年诺贝尔奖医学/生理奖。然而这一才历经十个年头的技术依然对于许多研究人员来说还是很陌生的，以下是有关RNAi技术在哺乳动物细胞中应用的具体设计策略，主要来自于《遗传》杂志2005年“RNA干涉（RNAi）技术应用于哺乳动物细胞的研究策略”，希望能给从事或者准备从事RNAi相关实验的研究人员以帮助。一、靶siRNA序列选择靶siRNAA序列选择是RNAi实验成败的关键。哺乳动物细胞RNAi实验中，使用最广泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA由正义链和反义链组成，两条链3’端均有2个碱基突出，一般为UU或dTdT，其中正义链的前19nt与靶基因序列相同。1. siRNA设计的原则SiRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100—200bp至翻译终止密码上游d0—100bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA3’端相邻19个核苷

一、RNAi的分子机制通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还

近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA.RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示 了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程.现在越来越多的研究人员开始采用RNAi 来研究生物体的基因表达.RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等.目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：·化学合成·体外转录·长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)·siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs·PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步,而转染的

1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存（置于-70 ℃，隔夜后，移到液氮）。2. 冷冻细胞解冻程序：2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之 血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。2.2. FBS （fetal bovine serum，胚牛血清），CS （calf serum，小牛血清）和HS （horse serum，马血清），对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。2.3. 将培养基置于37 ℃ 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入37 ℃ 水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后，以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 m

原代细胞冻存技术：1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）×106 /ml。5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。8、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。

做实验前要先学会冻存，以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞，且可减少污染或其它不利影响。1、影响冻存细胞活性的因素（1）细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，常用的浓度为5%-10%（90%小牛血清）。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。（2）细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成，因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1℃的速度，降至-20℃冻结。均可获得满意效果。（3）保存温度：液氮罐，可达到-196℃，此时所有的物理化学活动均降至最低限度，以保证细胞长期保存。（4）复苏：急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃~43℃的水浴中，30秒至一分钟内融化。2、冻存与复苏方法适用于原始组织、原代细胞和细胞系（株）。（1）细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2~5X106/ml。（2）分装于2ml冻存管中，装量1ml，封口，作好标记，用几层纱布扎好。（3） 冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程，以1℃/min的速度降温，一般挂在液氮上空8小时后，投入液氮贮存罐中长期保存。（4）为使冻存的细胞复苏，将冻存管置于37℃~43

1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质。例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。4、冷冻保存之细胞浓度：（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 ce

浅谈流式核内蛋白染色步骤：1、染表面抗体 按说明书条件孵育全血样品孵育抗体后加入不含固定剂的溶血素（按厂家说明操作）溶血完毕。2、用2ml预冷流式染色缓冲液（Flow Cytometry Staining Buffer）洗涤细胞300-400g离心5分钟，去上清。3、用3倍体积的固定/破膜稀释液（#00-5223）稀释固定/破膜浓缩液（#00-5123）制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每个样本的用量为1ml 。4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（1:3稀释好）再次旋涡混匀，避光4℃孵育30分钟到60分钟。5、将破膜缓冲液（#00-8333）用去离子水1:9稀释，制成工作液（每个样本的用量为4~5ml）。6、无需洗涤，直接加入2ml破膜缓冲液工作液（1：9稀释好）300-400g离心洗涤细胞并弃去上清液（可选）重复洗涤一次。7、加入100 ul流式染色缓冲液重悬细胞体系中加入2 ul 胞内抗体来源的血清，室温避光孵育30分钟。8、体系加入适量的核内（及胞浆）抗原抗体，对照管加入等量的同型对照，按说明书条件孵育。9、加入2ml破膜缓冲液工作液离心洗涤细胞并弃去上清液（

一、原理1、E .coli 表达系统E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。二、材料1、诱导表达材料(1 )LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10gNaCl10g 琼脂 (Agar)1-2%蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌(2 )IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中，0 .22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 ml /份，－20 ℃ 保存。(3 )l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris

一、SP 法1）脱蜡、水化；2）PBS 洗 2～3 次各 5 分钟；3）3% H2O2（80% 甲醇）滴加在 TMA 上，室温静置 10 分钟；4）PBS 洗 2～3 次各 5 分钟；5）抗原修复；6）PBS 洗 2～3 次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温 20 分钟。甩去多余液体。8）滴加Ⅰ抗 50μl，室温静置 1 小时或者4℃过夜或者37℃1小时。9）4℃ 过夜后需在37℃复温45分钟。10）PBS 洗 3 次各 5 分钟；11）滴加 Ⅱ 抗 40～50 μl，室温静置，或 37℃ 1 小时；12）II抗中可加入 0.05% 的 tween-20。13）PBS 洗 3 次各 5 分钟；14）DAB 显色 5～10 分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗 10 分钟；16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗 10～15 分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。二、SABC法1）脱蜡、水化。2）PBS 洗两次各 5 分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS洗5分钟。6）滴加正

ELISA检测系统可谓是免疫学反应应用到科研生产中最为广泛最为灵敏的技术手段。可是在新老手操作过程中总是会出现或大或小的问题,本人在刚开始做ELISA时就面临很多困难,虽然有师兄师姐铺路,但还是常常做得一塌糊涂,比如说花板,假阳性,全显色,全部显色,显色比空白还低......自己也为此苦恼过很长一段时间,随着自己技术水平得提高,或多或少地也掌握了ELISA体系的脾气,也是熟能生巧吧,现在做方阵,做ELISA已是轻车熟路了,以前检测一种抗体用整整一下午还算得晕晕的,现在给我十个八个的从包被到显色,一个工作日基本搞定.下面就由我抛砖引玉地来说一下,做ELISA的经验总结:1.包被原的性质很重要,蛋白浓度,是否降解,这关系到你做出的抗体可不可以被其识别,所以保存抗原很重要,我做重组蛋白时,师兄都严格警告我一定要在冰浴下缓慢融化就是这个道理.还有有的包被原可能不是蛋白,对于生物素和脂类物质或小分子物质我们要事先对其改造再加以包被,我把方法简要的列出如下:①亲和素生物素:先亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。②脂类物质:可将其在有机

实验流程：多靶点免疫荧光染色的实验操作与普通单标记免疫组化流程相似。试剂盒中的荧光染料可以在HRP酶的作用下将信号共价结合到抗原上，随后即可衔接下一轮单标染色，直至全部标记完成，即可复染DAPI后封片观察。1.脱蜡水合：1）新鲜二甲苯浸片10min,重复3次。2）梯度乙醇浸片，100% 5min；95% 5min；70% 2min。3）灭菌水洗片1min，重复3次。4）10%中性福尔马林浸片10min，灭菌水洗片1min，重复3次。2.微波修复：1)将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1×工作液浸没。2）将修复杯置于微波炉内高火煮沸。3）低火维持15min。4）取出室温自然冷却至室温。3.封闭：1）去除玻片上残存洗液。2）用组画笔圈出玻片上的样本区域，滴加封闭剂，覆盖样本区域。3）室温保湿震荡10min。4.一抗孵育：1）去除玻片上的封闭剂。2）用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。3) 37℃恒温保湿震荡孵育1hr。4）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。5.二抗孵育：1）去除玻片上残存的洗液。2）直接滴加二抗溶液，浸没样本区域。3）室温保湿震荡孵育1

一、目的研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化 RNA。RNA 质量的高低经常影响 RT-PCR、cDNA 库构建和 Northern Blot 等分子生物学实验的成败。 二、主要试剂Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 1. Trizol 试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注重操作。 2. RNase 污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。 3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分 RNA 会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源 RNase 降解了 RNA。 4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特别结构，可以加入 Trizol 试剂同时加入无 RNase 的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。2-8℃ 避光保存一年。 三、预备工作RNA酶（Rnase）是导致 RNA 降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除

RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 操作步骤： 1. 匀浆处理： ① 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。 ② 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 ③ 细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106 动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA

在收集到生物材料之后，最好能即可进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1. 提取组织RNA时，每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解：提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在试问15~30℃下放置5分钟；3. 在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15~30℃）放置2~3分钟后，12000g（2~8℃）离心15分钟；4. 去上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30℃）放置10分钟后，12000g（2~8℃）离心10分钟；5. 弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2~8℃）离心

一、引言在许多的细胞生命活动中，例如 DNA 复制、mRNA 转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到 DNA 与蛋白质之间的相互作用的问题。重组 DNA 技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要：1. 鉴定分析参与基因表达调控的 DNA 元件。2. 分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子。这些问题的研究都涉及到 DNA 与蛋白质之间的相互作用。研究 DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：1. 凝胶阻滞实验。2. DNase1 足迹实验。3. 甲基化干扰实验。4. 体内足迹实验。5. 拉下实验。 二、凝胶阻滞实验1. 概念：凝胶阻滞实验（Gelretardationassay），要叫做 DNA 迁移率变动试验（DNAmobilityshiftassay）或条带阻滞实验（Bandretardationassay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究 DNA 与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。2. 原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA 分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反

转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。其中，核酸包括DNA （质粒和线性双链DNA ），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。转化特指将质粒DNA 或以其为载体构建的重组DNA 导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试

Purpose Materials10ml 6% dextran + 7ml citrate/citric acidDextran: T500 --> 6g+100ml PBSCitrate solution: 25g Na Citrate + 8g citric acid + 500 ml PBS 43 ml blood 12 ml RT Histopaque 107718 ml cold H2 O2 ml 10x PBSM199 for HUVECs: 1L powder pocket M199 + 35g NaHCO3 + 25mM Hepes + 5 mM glutamine + 50 ug/ml Gentamycin.1M Hepes: 119.1 g Hepes + 500 ml dH2 O.Media A: 1X HBSS (10X:50ml) + 10 mM Hepes (1M: 5 ml) + 5 mM EDTA (0.5M: 5ml) + 2.5 % FBS (12.5 ml) in 500 ml.Media B: RPMI1640 470 ml + Ge

一、环境和液流的消毒1、准备足量的无菌1×PBS（3L左右）和去离子水（10L左右）。PBS和去离子水可高压灭菌，sheath桶和装DI水的5L小桶依次用75％ 医用酒精和无菌去离子水各涮洗三次，然后将无菌PBS和去离子水分别注入相应桶内即可。2、房间在分选前紫外灯照射15－20分钟；用1:50新洁尔灭拖地；用75％ 医用酒精擦拭工作台和收集架；用75％ 医用酒精喷洒分选细胞收集区和上样区。二、开机和管道的消毒1、将Sheath液换为活性氯浓度为0.5% 的次氯酸钠溶液（不要用75％ 的酒精），开机。开机前，先掀起流动室和分选室的罩盖，开启电源，打开计算机并等计算机进入WINDOWS系统后，打开激光电源，运行FACSDiva软件，联机成功后，执行Fluidics startup命令。然后从FACSDiva的sort菜单进入sort setup，选择合适的液流压力（high、 middle、low）。一般来说，100 μm的喷嘴选用Low，而70 μm的喷嘴选用middle。2、打开breakoff window，点击显示窗上的液流开关，检查液流是否正好流入废液槽中间和液流的形态是否正常