要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot。虽然,顺利的时候Western Blot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦…… 毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的。所以,严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用的。 我们知道,要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础。特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析。艾美捷向您推荐使用内参抗体来检测您的实验系统,或者校准您的实验结果。 内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定
(一)粪大肠菌群与大肠菌群的关系 根据国家颁布的食品卫生微生物检验标准方法(GB4789.3—94),粪大肠菌群(Fae—cal coliform)系指一群能在44 ℃24 h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产生靛基质,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。表5—3中的大肠艾希氏菌I型即属粪大肠菌群。 粪大肠菌群的唯一来源是粪便,因此,唯有粪大肠菌群是粪便污染的确切指标。在被检样品中,如果有粪大肠菌群存在,则在大肠菌群检验中也被计入。因此,也有将大肠菌群数称为总大肠菌群数者。 近年来,曾有人建议采用大肠菌群和粪大肠菌群两种细菌作为食品卫生学的指标菌,如果大肠菌群和粪大肠菌群均高,一般多考虑为近期污染;如果大肠菌群数高,而粪大肠菌群数低,则应着重考虑粪便的远期污染,这在一定条件下,对污染的来源以及工艺学意义可作出恰当的判定。(二)检验步骤1.校样的稀释 同大肠菌群。2.44℃乳糖发酵试验 将检样以无菌操作接种于乳糖胆盐发酵管内(1 mL以上者1 mL及1 mL以内考,用单料乳糖胆盐发酵管),置(44土0.5) ℃水浴内,培养(24土2) h。经培养后,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气
WB 是实验室常见实验之一,蛋白定量后,上样之前,还需要哪些步骤制样呢?1. 蛋白含量测定后,Invent 建议大家把各个样品稀释到某一固定浓度(稀释可使用 PBS,水或裂解液),等体积等质量上样,计算上样体积时需包含 loading buffer 的体积。例如:把所有蛋白浓度都稀释到 2ug/ul,然后与 2Xloading buffer 1:1 混合后,浓度成为 1ug/ul,建议上样 20-30ul 即可。2. 与 loading buffer 混匀后,要将样品在沸水中煮 3-5 分钟,使蛋白充分变性。也可使用 PCR 仪 95°加热 5 分钟。PS:煮沸并非必须步骤,有些蛋白仅需 70℃ 煮或无需煮沸,具体请参照抗体要求操作。3. 煮沸后在冰上静置少许时间后进行低速离心,即可上样。剩余样品建议分装后保存,样品可以在 4℃ 冰箱短时间保存,也可以在-20 或-80℃ 保存,解冻后可重新煮沸上样。PS:样品冻存时间过长或反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变,故推荐大家使用 Invent 超快速柱式法蛋白提取试剂盒,仅需几分钟就可完成总蛋白制备,再也不用担心样品质量不好啦!扩展知识SDS
实验室玄学千千万,预测和结果不符占一半。WB 实验是各位艾粉们,时常光顾的一个实验。但就是这样一个初级又常用的实验,却会出现各种稀奇古怪的问题。比如在 WB 实验鉴定蛋白时,我们得到的蛋白质条带大小常常会和预测值有所偏差。这是身患「强迫症」的艾粉们不能忍的。如果是实验出错或者预测不准这种情况,小艾是没办法跳出手机屏幕救你了。但这下面的 5 条准则,艾粉们倒是可以珍藏一下,在遇到蛋白质条带大小和预测值偏差的时候,拿出来分析一下。我们可以对照着这张图来看原因。下面小艾就来详细地讲解一下这 5 条具体是个啥。当我们做 WB 实验鉴定蛋白的时候,最喜欢看到的是这样的条带:但通常,自己做出来的,就会变成这样:是生活对我们这些实验小可爱下手了吗?还是水逆没过去?为什么 WB 跑了这么多次,都和预测差了这么多?当然不是那些玄学流原因啦。让我们科学地分析一下到底是哪里出了问题。▪内源性蛋白 or 重组蛋白查问题要从源头查起,所以各位艾粉们要先看一看样品是内源性蛋白还是重组蛋白?如果是内源性蛋白还不打紧,如果是重组蛋白,那么马上就要看一看重组蛋白是否为全长序列了。假如样品是重组蛋白,还不是全长序列,那么
四. 细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH 计、磁力搅拌器。具体步骤:(1) 水的制备:细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.(2)PBS 的制备与消毒( 也可用于其它BSS ,如:Hanks ,D-Hanks 液的配制) :1. 溶解定容:将药品(NaCl 8.0g ,KCl 0.2g ,Na2 HPO4・ H2 O 1.56g ,KH2 PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml ,摇匀即成新配制的PBS 溶液。2. 移入溶液瓶内待消毒:将PBS 倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8 磅消毒20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。(3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒:胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH 为8.0 、温度为37℃ 时,胰酶溶液的作用
悬浮细胞一般几天离心一次,觉得好难养啊!求心得?丁香园网友goingba认为:你养的是什么细胞,原代吗?我觉得悬浮细胞最好养了,不用消化,关于几天离一次心,要看你的细胞生长状态了,我养过血液肿瘤细胞,增值比较快,我一般是第二天半量换液(加等量培养基后一分二),第三天若长得比较满,就离心换液。若你不想每天都去管它,你可以把细胞密度中的相对稀一点(不能太稀,太细了细胞不好好长),可以2-3天换一次液(半量,不用离心),这要看细胞状态,和你试验进度,若你急着用细胞,那就将细胞中密一点,天天换液,用胎牛血清,这样细胞会疯长的。要是比较娇气的细胞,象RPMI-8226,一定要用胎牛血清,2-3天半量换液,依据细胞状态再离心换液,等细胞进入对数生长期了,养起来也就好养了。若是正常人T细胞,也要3-5天换一次液,最好3天的时候加入些新培养基,我曾经有一次1周忘了换液(因为T细胞增殖很慢,或者说在体外不给刺激基本不增殖,所以培养基的颜色不发生改变,但它也消耗营养),最后作流式发现细胞大部分凋亡和死亡了。我养的是JURKAT,细胞状态不太好,都给他吃20%胎牛血清了,听说这细胞挺好样,可能刚复苏不好养,
一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。何谓PCR简单的说,PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。PCR的要素基本的PCR须具备1.要被复制的DNA模板 (Template) 2.界定复制范围两端的引物(Primers). 3.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤,分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。 所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性, 将双股的DNA加热后转为
PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计,酶的质量。模板的制备,在前二者都稳定可行的情况下,PCR模板的制备尤为重要。模板处理方法的选择及操作人员的基本技能,决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败。而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子,提高模板核酸的产量。传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份,溶解细胞膜,使蛋白质变性,再用蛋白酶K来消化去除蛋白质,尤其是与DNA结合的蛋白质,再用酚:氯仿抽提,然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸,供PCR实验用。但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法。亦可满足PCR实验的要求。采用哪种方法消化 处理标本,视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定。模板核酸的提取制备方法 一、蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理,尤以DNA样品为佳。如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿,粪便等。1、试剂配制1)蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)10mmol/LED
佚名 DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成,复制开始时,双链打开,形成一个复制叉(replicative fork,从打开的起点向一个方向形成)或一个复制泡(replicative bubble,从打开的起点向两个方向形成。)两条单链分别做模板。各自合成一条新的DNA链。由于DNA一条链的走向是5′→3′方向,另一条链的走向是3′→5′方向,但生物体内DNA聚合酶只能催化DNA从5′→3′的方向合成。那么,两条方向不同的链怎样才能做模板呢?这个问题由日本学者岗崎先生解决。 原来,在以3′→5′方向的母链为模板时,复制合成出一条5′→3′方向的前导链(leadingstrand),前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的,因此前导链的合成是连续进行的,而另一条母链DNA是5′→3′方向,它作为模板时,复制合成许多条5′→3′方向的短链,叫做随从链(lagging strand),随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成,这些片段就叫做岗崎片段(Okazaki
定量免疫荧光测定激光扫描共聚焦显微镜可以对经过荧光标记的组织标本共聚焦荧光进行定量分析.并显示荧光沿Z轴的强度变化。它除了可以对单、双或三重标记的细胞及组织标本的荧光进行定量、定位分析外,还可以借助显微CT功能在不损失分辨率的前提下对标本深层进行荧光分布的测量.获得组织形态结构信息。激光扫描共聚焦显微镜同样适用于高灵敏度的快速免疫荧光测定,从而准确检测抗原表达、荧光原位杂交斑点及组织细胞结构的形态学特性,并作定量分析。先按照免疫荧光组织化学技术进行荧光染色,再用激光扫描共聚焦显微镜对其进行定量和形态学分析。我国学者为确定某些物质(如猪苓多糖)是否对培养的膀胱癌T!细胞抑癌基因p53和抑制细胞凋亡基因蛋白H-fas表达有调节作用,用激光扫描共聚焦显微镜对经免疫荧光细胞化学染色的细胞进行共聚焦荧光断层扫描成像,每个细胞扫32个切面,用三维和定量软件观察与测定细胞内荧光变化,细胞培养24小时,对照组p53主要在细胞核内表达,阳性信号呈黄绿色亮点,点状分布,呈现一核多点表达,荧光强度较弱,为119±43。实验组细胞核内强荧光,为170±13,细胞质内也有强表达,呈弥散性分布。对于培养细胞的H-
[实验原理] 总RNA,经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA,以寡聚(d丁)为引物,经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链;经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶,以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链,最后形成双链cDNA。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器和材料 紫外线透射仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统 (二)试剂 特异引物、逆转录试剂盒 [实验步骤] (一)cDNA的合成 1、取约9uL mRNA,依次加入:第一链缓冲液4uL,RNA酶抑制剂1 uL,Oligo(dT)引物2uL,dNTP混合液2uL AMV逆转录酶2uL,混匀,离心10min,42℃水浴1h。 2、在冰上于第一链反应产物中,加入以下试剂:第二链缓冲液然40uL,RNA酶H 1uL,大肠杆菌DNA聚合酶5uL,DEPC处理过的水至100uL,混匀,离心10s,12℃、22℃、65℃水浴各1h。 3、加入T4DNA聚合酶,振荡混匀后离心10s,37℃水浴10min。 4、加入10uL 200mmol/L EDTA和2ul SDS(10%,W/
[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。由于2’,3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH,当它参入到DNA链后,3’-OH末端消失,使DNA链的延伸终止。本实验根据此原理,将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体,并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火,随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。实际操作中同时进行,分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物,其中—种dATP为32P标记物,以便能用放射自显影法读序。但在这4个反应体系中,分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP),这样ddNTP可随机参入正在延伸的DNA链上,使链延伸终止。例如在“A”管中加ddATP,反应结束时,管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段,而且这些片段都带放射性。将反应物加在高分辨凝胶上电泳,DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离,短的走在前端,长的泳动在后面。其他3管则
1.PCR技术PolymeraseChainReaction聚合酶链反应它是一种模拟天然DNA复制过程,在有DNA模板、DNA聚合酶(Taq酶)、RNA引物和四种dNTP的情况下,通过高温变性(90℃-95℃,1-2min),低温退火(25℃-37℃,1-2min),中温延伸(60℃-75℃,90sec-5min),这样反复循环的过程中,在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。1)、PCR反应成分: TaqDNA聚合酶引物浓度:一般0.1-0.5μmol/LdNTP:一般为50-200μmol/LMg2+ 模板:PCR对模板的要求不高,单、双链DNA均可,但样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。添加剂:DMSO(二甲基亚枫),提高扩增效率及特异性(1)理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍,应按2n的指数方式递增,PCR反应30轮循环后,PCR扩增应达到230个拷贝,约109个拷贝。但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素的影响,实际扩增效率比预期的要低,一般可达106-107个拷贝平台效应”:PCR反应
相关专题 重组DNA技术工具酶 DNA聚合酶与DNA连接 酶的作用如何区别 DNA聚合酶主要连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,在DNA复制中起做用;DNA连接酶主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键,起连接作用.在基因工程 中起作用,同时DNA连接酶在DNA复制中也起作用,比如岗琦片段的连接! 复习资料:几种酶的比较 限制性核酸内切酶(以下简称限制酶):限制酶主要存在于微生物(细菌、霉菌等)中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶(“分子手术刀”)。发现于原核生物体内,现已分离出100多种,几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组 DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如,从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列,并在G和A之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶,它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因,就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。 DNA连接酶:主要是连接DNA片段之间的
一、概述T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA聚合酶用适当方法处理后,可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称T7测序酶。使用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此, 放射自显影所得到的结果较为清晰易辩,对于许多模板来说,使用含有dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而,如果出现了带压缩的问题,则用含dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入,使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。T7测序酶具有很高的聚合速度,并有高度的延续性,正因如此,该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止,整个反应在很短的时间内完成,并且不需要进行追加反应(Chase step)。然而对于有紧密二级结构的区域,错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况,应使用一些高温DNA聚合酶,如Promega公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA聚合酶独有的耐热特性,测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。T7 DNA聚合酶测序的快速而简
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。一、 PCR反应中的主要成份1、引物:PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:(1) 引物长度约为16-30bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。(3)
一、 DNA聚合酶的选择 实验室常用 DNA聚合酶有三种:TaKaRa TaqTM,TaKaRa EXTaqTM和 PyrobestTMDNA Polymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA 聚合酶,保真性较差,但价钱便宜,一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有 Proof reading活性的耐热性 DNA聚合酶,具有一定的保真性,而且其扩增得到的PCR产物 3’端附有一个 “A ”碱基,如果希望直接将产物克隆 到 T -vector可以用此酶。PyrobestTMDNA Polymerase 也是具有Proof reading 活性的耐热性DNA 聚合酶,其特点是保真性极高,扩增得到的 PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增 请使用此酶。 二、按下列组成在PCR 反应管中调制反应液 TaKaRaTaqTM或TaKaRaE XTaqTM的配方 Reagent Quantity,for 50µ l of reactionmixture 10X PCR buffer
引物(primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 引物的重要性 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合,不与其他非目的DNA结合,PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸,可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。 引物设计原则 引物长度 一般为15-30个核苷酸,在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物,但最多不超过50个核苷酸。 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%:GC含量太低导致引物Tm值较低,使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性;GC含量太高也易于引发非特异扩增。 引物Tm值 一般要求:55℃-65℃。 计算:对于低于20个碱基的引物,Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物,Tm值则需要考虑热动力学参数,从“最近邻位”的计算方式得到,这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm = △H/(△ S
通过 TCR 与 MHC 多肽复合物间的特异性识别作用,可以对抗原特异性 T 细胞进行检测和分离。然而,当 MHC 多肽复合物为单体状态时,其与 T 细胞的结合并不稳定。若将其四聚体化后,其与 TCR 的结合可保持在一个稳定的状态,成为检测的工具。德国 IBA Lifesciences 研发的 MHC I STREPTAMERS® 技术,利用了这一特点,将传统的链霉亲和素改进为 Strep -Tactin®,搭配荧光标记或纳米磁珠,与多聚化的低亲和力MHC I-Streps 形成复合体,实现了对抗原特异性 (CD8+ T) 细胞的检测和分离 (如,流式分析) 。此技术的特点在于,荧光或磁性微珠等标记物可以通过使用 Biotin (生物素) 而去除,保留了细胞的真实特性,得到的功能性的,label-free 的细胞可用于下游的实验研究。1) MHC I STREPTAMERS® 技术解析MHC I STREPTAMERS® 由两部分组成:· MHC I-Strep,即连接了 Twin-Strep-tag® 和抗原肽的 MHC I 分子。· 荧光 (PE/APC) 或磁性微珠标记的 St
1. 分选原理源自德国 IBA Lifesciences 的多重磁珠阳选,选后细胞无试剂残留(即 label-free)的特性,非常适用于分选一些需要用多种 marker 才能准确鉴定的细胞,如 Tcm,Tn,Treg 细胞。假如现在我们想用 CD8+CD62L+ CD45RA- 这几个 marker来分选 Tcm 细胞,首先我们可以通过磁珠法阳选先得到 CD8+的细胞,将分选得到的细胞上结合的磁珠等分选试剂去除后,再分选出 CD62L+ 的细胞,这样获得到CD62L+CD8 + 的高纯度 T 细胞靶标群体。最后去除掉 CD45RA 以进行分离得到 naïve 或 memory (CD45RA-) T 细胞。2. 实验流程Step 1:CD8-Fab 片段能特异性识别细胞表面的 CD8 抗原分子,Twin-Strep-tag® 通过与Strep-Tactin® 多聚体结合后,抓取到 CD8+目的细胞。Strep-Tactin® 多聚体上连接磁珠,即可通过磁极分选出 CD8+ 细胞。 Step 2:通过加入生物素,竞争结合掉 Strep-Tactin® 多聚体。一旦 Fab-Strep