茫茫的实验过程中，你是否遇到过如下的困境：做完 PCR，跑胶发现有多条很诡异的条带……更为可怕的是，做完二代测序发现了一个崭新的突变点，一代测序验证也能开心的验证出来，但发文章时，别人告诉我们，这其实是相似序列引发的假阳性……也就是说，相似序列之间的差异碱基，刚好就是那个所谓的突变点！一代测序也枉然！以上的问题，可能多半都是因为引物不特异。也就是说，同一对引物，能匹配基因组上好几个位置。所以，设计完引物，做一个在线的 PCR，以保证引物的特异性，是特别好的习惯~下面分享两个可以完成此任务的在线工具！1. Primer-BLASThttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi以 ERBB2 基因的某个外显子为例，序列如下：随意拉出一对引物F: CAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCTR: ACCCTAGAGTCTCATTGGGCAGGGCC用以扩增出此段的 DNA 序列，打开 PRIMER-BLAST，Template 空置，引物填入对应的位置PCR 产物最大值可以根据，实验具体情况进行调整，选

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA），根据名称我们就可以知道这是一种对基因进行富集的工具和方法。其基本思想是使用预设定的基因集（通常是基因组注释信息或者来自前人、牛人的实验结果），即将基因富集，把功能相似或者相同的基因进行组合，并最终以基因集的形式进行封装；然后将 case 和 control 组中差异表达的基因进行排序，之后检验两组中差异表达的基因是否在预先设定的基因集合的顶端或者尾端富集。如果在最终的分析结果中，case 和 control 中差异表达的基因分别富集到顶端或者尾端，那么可以说明两组在所选通路或者所选功能基因集上具有差异。下面，我们将介绍如何去下载安装并使用该软件吧～1. 首先，打开 GSEA 的官网：http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp可以看到 GSEA 的介绍，和最新版本的改动时间等。2. 接着，点击 download，在下载页面可以看到有很多板块，各个板块包含了不同的信息，这里不一一赘述，大家可以自行查看。在 JavaGSEA Desktop Appl

ELISA试剂盒的结果判定分为定性和定量两种 ，在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。那么两类结果如何判断呢？一、竞争法在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为敏感。竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。1、阳性判定值法与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，ELISA试剂盒但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为125±100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值（NCX）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如0.300）,试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000，而且

贴壁细胞需要用到一种特定的试剂——蛋白酶，其作用是切断细胞和容器之间，细胞与细胞之间的相互粘连，用蛋白酶处理细胞的过程叫做「消化」，「消化」之后的下拨会形成单细胞并从容器底部掉下来。最常用的蛋白酶是胰蛋白酶。材料准备：1、预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37℃ 水浴锅内预热；2、用 75% 酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。传代流程：1. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。2. 从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。3. 将培养瓶放入超净工作台后打开瓶口，同时要在酒精灯上烧口消毒。4. 加入消化液：小心吸出旧培养液，用 PBS 清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞较好好，消化温度是 37℃。5. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。6

为了研究某一基因的功能，我们通常不仅需要研究其野生型基因的功能，也需要进一步去挖掘它发挥作用时是哪一个结构域，甚至是哪一个氨基酸发挥了作用，而这里面就涉及到了如何设计定点突变引物的问题。今天为大家介绍一个在线网址—quickchange primer design，可以非常方便快捷为我们设计出合适的引物。网站链接：https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp 该网站可以设计单点和多点突变引物以及删除或者插入一段 DNA 序列（插入时只能插入小的 DNA 片段）。我们今天着重讲解如何利用该网站设计引物，并利用该引物构建出我们想要的突变体。如果我们实验室又穷，又不想买突变试剂盒怎么办？我们可以不用管第 2 步，默认其设置，不用试剂盒也可以构建出我们想要的突变体。第 3 个选项输入我们的 DNA 序列，既可以通过 Browse 选项上传已经下载好的序列，也可以直接粘贴文本格式或 FASTA 格式的 DNA 序列。第 4 步将 DNA 序列转换成蛋白序列（Upload Translated）。下面我们以人的 TP53 基因为例进行演

今天小编给大家安利一个功能强大的网站 Oncomir，可以分析 miRNA 与患者预后的关系。网站链接：http://www.oncomir.org/这是 Oncomir 的主页，下面我们来看网站的功能。在数据库的左侧是不同的功能选项，我们看到首先是：1. Search by miRNA： 根据 miRNA 进行搜索;2. Search by Cancer Type：根据肿瘤类型进行搜索;3. Search for miRNA-target correlation: 搜索 miRNA 和靶基因的相关性；4. Survival Signature Analysis：生存分析；5. Clustering Analysis：聚类分析。1、根据 miRNA 进行搜索1）Tumor Development：查询某条 miRNA 在肿瘤组和对照组是否表达异常：以案例的 miRNA hsa-miR- 92a- 3p 为例，单击 Retrieve cancer types：结果显示 hsa-miR- 92a- 3p 在 14 个肿瘤里面显著表达异常。2）Tumor Stage and Grade：还是

今天小编给大家安利一个可以免费下载知网文献的网站——iData。网址：https://www.cn-ki.net/基本信息iData 是由北京大学、清华大学、浙江大学、复旦大学等师生学者共同筹建的用于教学、科研目的的公益互联网项目，旨在促进知识的传播和最新学术科技的共享。iData 平台上所有信息均为公开发表的学术文献，由学者自由上传，并提供有限的免费浏览、下载服务。进入网站，首页简洁，网站的功能非常清晰明了。为了获得更好的用户体验，强烈推荐使用谷歌浏览器访问，告别卡死出错等问题。如何下载文献？献下载非常简单，在搜索框输入想要查找的关键词即可。找到感兴趣的文章，点击下载全文即可下载。下载的文件为 PDF 格式， 再也不用下载专门的阅读器了。同时，你也可以使用 cnki 镜像，他的数据和 cnki 官网保持同步。那么，如何进入 cnki 镜像呢？只需点击「高级检索」，然后再点击右上方「中文学术镜像」即可进入。可以下载哪些文献？中文期刊、硕博、会议、报纸全库都可以下载，以及部分的年鉴内容 (年鉴需要通过 cnki 镜像下载)，如果其中有不能下载的文献，可以发送邮件至 idata@cn-ki

今天我们继续给大家分享可以免费下载文献的网站！网站链接：http://wap.gxlib.org.cn:9080 /ermsClient/browse.do这个网站不仅仅可以下载万方、维普等数据库的文献哦～在这里你还可以下载各方向的学位论文、期刊数据等，更多宝藏大家可以自行挖掘，该网站甚至还包括了百度文库的免费入口，可以说非常良心了，在这里给广西壮族自治区图书馆点个大大的赞。如果国内各大图书馆都这么给力，哪里还需要我们在这里苦苦搜寻各种免费方法！图书馆需要注册才可以免费下载哦，你只要按照他们的引导网上注册之后就可以通过该网站的入口免费下载文献了，注册的流程我们就不详细解读了，下面我们就以万方为例给大家讲解一下。首先进入该网站，找到所需数据库的入口处，点击包库入口：点击包库入口，进入相应的搜多界面，弹出登录界面，已经注册的直接登录，没有注册的可以点击右下角的「用户注册」，按照引导注册即可，亲测可用！登录之后就到了搜索界面，我们可以看到已经以广西壮族自治区图书馆的身份登录了。接下来就可以愉快的搜索下载文献了！我们搜索「肝癌治疗」，搜索结果界面就有下载图标，直接点击下载就可以了：还可以通过点

就如上新手进阶要点总结之后，笔者总结了一下免疫荧光需要特别关注的细节，以期作出更完美的图片效果。1、了解及预测蛋白的定位例如：下图使用肺动脉内皮细胞（ BPAE）观察线粒体的显色，采用 405nm，488nm，561nm 的激光，100x NA 1.49 的物镜对细胞内线粒体的分布进行简单的观察，此图可见，单纯的 mito-tracker 并不能清晰看见线粒体内部的结构和蛋白相关关系，因此，明确蛋白定位，根据所需分辨率选择显微镜、相应的荧光蛋白和探针非常重要。比如研究者应大致预测观察目标是存在于线粒体外膜表面，或者线粒体嵴上，或者仅需观察经处理后线粒体的形态及分布以选择不同的荧光蛋白/荧光有机小分子探针/纳米荧光探针等 （一般来说荧光蛋白比小分子荧光探针体积更大，在超微显像过程中较大小分子荧光探针等更有利于显微结构的染色）。2、减少背景噪声一张清晰的研究图片应当避免过多的干扰光点出现。在免疫荧光实验中，应尽量保证每次 PBS 清洗次数和时间，减少杂质。细胞免疫荧光相比较于组织免疫荧光略有区别，一抗应在孔板内完成孵育步骤，载玻片上孵一抗时免疫组化笔干燥结块脱落会引起再爬片杂光。此外尽量保

PCR 是一个坑，坑里埋了好多研究僧……PCR 是众位「研究僧」日常实验中最常用的技术，可谓是「研究盛宴」中的一道「小菜」。可也有不少童鞋反映，这道菜不好吃，一不小心就「小河里翻船」。那么，我们该如何把这道菜「吃好」、跳出这个「坑」呢？诸位看官莫急，待我送君「三大法宝」。一、确保 RNA 样本合格常见的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法，这两个方法各有所长，但都不能保证提取的 RNA 样本一定合格。因而，提取完成后应测定 RNA 的浓度及吸光度。通常，在 260，280，230 nm 处分别测定其吸光度（A260、A280、A230）并计算其比值（A260 /A280，A260 /A230）。那么，这几个数值及其比值分别有何意义？A260 为核酸的吸光度，A280 为蛋白质的吸光度，A230 为其他杂质（多糖等）的吸光度。纯 DNA 的 A260 /A280 为 1.8，纯 RNA 的 A260 /A280 为 2.0。如果 OD 比值不在范围内该如何解决呢？再次洗涤样本！75% 乙醇沉淀 RNA 后重新吸附、洗涤；若采用 TRIzol 法提取 RNA，可直接洗涤两次。洗涤

一、用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1. 将目的基因与 IPTG 诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的 LB 平板，37℃ 培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。2. 分别挑取对照菌和重组菌 1 个菌落，接种于 1 ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中，37℃ 通气培养过夜。3. 取 100 微升过夜培养物接种于 5 ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中（各 10 份），适当的温度（20－37℃）震荡培养 4 小时，至对数中期（A550＝0.1 - 1.0）。4. 对照菌和重组菌各取 1 ml 未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度分别为 0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 mM 相同的温度继续通气培养。5. 在诱导的 1，2，3，4，5 个小时取 1 ml 样品于 Ep 管中。细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统

卡方检验对原始数据有一定的要求，只有符合卡方检验前提条件的数据才可以使用卡方检验，否则，必须改用其他检验方法。因此，没有充分了解卡方检验的前提条件，就有可能进入卡方检验的误区，从而你导致统计结论不准确，对科研成果的准确性造成巨大影响。小编整理了小伙伴容易陷入的卡方检验 5 大误区，来瞅瞅你中招了没？误区 1：总样本量低于 40，不能使用卡方检验卡方检验的第一个前提条件是要求总样本量大于 40，如果总样本小于或者等于 40 时，卡方检验失效，要改用 Fisher 确切概率法。误区 2：理论频数低于 5 的单元格个数超过 20%，不能使用卡方检验以 SPSS 卡方检验输出结果为例：上图详细讲述了为什么频数低于 5 的单元格的个数占比为 50%。卡方检验的第二个前提条件是要求理论频数低于 5 的单元格个数不超过 20%，如果超过了 20%，则卡方检验失效，要改用 Fisher 确切概率法。误区 3：某一单元格出现了频数 0，不能使用卡方检验当某一单元格出现 0 时，卡方检验失效，必须改用 Fisher 确切概率法，如下图所示： 实验组 0 人发生事件，改用 Fisher 确切概率法检验构成比

相信经常与大鼠、小鼠打交道的老师都碰到过这样的情况：大鼠、小鼠不配合，导致我们无法进行相应的操作，比如注射，采血等；又比如被大鼠、小鼠咬住了，等到回过神来，发现大鼠或者小鼠已经重重的掉到地上或者实验台上…… 诸如此类的情况相信还有很多。这些都是我们自己和大鼠、小鼠的本能反应，那如何操作能让我们顺利完成相应的实验，同时小鼠也能相对舒服呢？今天，我们就说说大鼠与小鼠的固定方法。首先引入两个术语: Handling (处理) 和 Restraint (限制)。大鼠与小鼠的固定需要 Handling (处理) 和 Restraint (限制) 才能安全顺利的进行。Handling 的定义为通过我们的手直接或间接，触碰动物或者不触碰动物来操作大鼠或者小鼠。Handling 方法会因动物而不同，需要冷静且坚定方式，避免伤害小鼠，尽可能创造一个安全的实验条件和环境。Restraint 的定义为通过手或者借助物理装置固定大鼠或者小鼠，使其整个身体或者部分身体处于一种舒适和安全的状态。Restraint 措施对于进行实验工作是必不可少的，它们有助于避免动物受伤，并为动物处理者提供足够的安全。舒服的 Ha

1 ．固定 ：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。 Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。 PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 2 ．组织脱水，透明 ：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。 3 ．切片时展片： 有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。 4 ．烤片： 60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。 5 ．蜡块及切片的保存： 最好在4℃保存 6 ．脱片问题 ： Poly-L-

植物组织培养常见问题解析1. 培养基的配制注意事项植物组织培养最常用到 MS 培养基，包含十几种化合物。因为有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀，影响培养基的营养成分，准备 MS 培养基需要配制多种高倍母液。且配制母液时，尤其涉及大量元素的母液时，一定要等一种成分溶解之后，再缓慢的添加另一种成分，切记「一锅煮」，即不能将各种化合物一齐添加进去。可选用 Coolaber 的 MS 培养基基盐（PM1011）在自行加入蔗糖和琼脂配制 MS 培养基，既经济，更高效。2. 灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感，pH 值低于 5 很难成胶或凝胶偏软，切记高压灭菌前调节培养基 pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝胶对二价阳离子浓度有要求，也就是相对于 MS 培养基，1 / 2MS 培养基中植物凝胶要适当增加用量。另外灭菌后，倒出培养基前一定将培养基摇匀（带防烫手套），因为是琼脂密度大底层含量高，容易造成培养基强度不均匀。选择 Coolaber 改良 MS 培养基（PM10121，pH5.8±0.2）含蔗糖和琼脂/植物凝胶，可以省去调 pH 步骤。3. 水解酪蛋白有酸水解和

RT-qPCR 实验包括 RNA 提取与质量评估，逆转录和 qPCR 三大步骤，每个步骤都有很多注意事项，下面给您详细介绍。RNA 质量评估在 RT-qPCR 实验中，RNA 提取完成后，需要对 RNA 的质量进行评估，合格后才可进行后续实验。评估方法有分光光度计，琼脂糖凝胶电泳，Agilent 2100 分析等，其中最常用的有分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法检测。我们需要注意的是这两种方法需要搭配使用，才能完成对 RNA 浓度、纯度和完整度的检测分析，以保证 RNA 的质量。分光光度计：分光光度计主要用于测定 RNA 的浓度和纯度，但不能对 RNA 的完整度和基因组残留进行检测。其中，A260 / 280 和 A260 / 230 是 RNA 纯度检测的重要参数，可根据其数值的波动，检测 RNA 的纯度：1、1.9< A260 / 280< 2.1，说明 RNA 纯度较好；A260 / 280<1.9，表示 280="" rna="">2.1，表示 RNA 可能有部分降解，可经琼脂糖凝胶电泳进一步确认。2、2.0< A260 / 230< 2.2，说明

外泌体不管是在基础科研、临床应用，还是商业研发，都相当火热，给大家介绍一个超强的外泌体数据库：exoRBase。exoRBase 数据库共收录了 58330 种 circRNAs，15501 种 lncRNAs，18333 种 mRNAs，它们来自 92 份血清外泌体 RNA-seq 实验数据，包括正常人（NP）、冠心病（CHD）、结直肠癌（CRC）、肝细胞癌（HCC）、胰腺腺癌（PAAD）和乳腺癌（BC）等样本。作者还依据 GTEx project 获得组织特异性 RNA 表达特征，分析了相关 RNA 分子的组织来源。一、浏览功能区使用1. 点击进入 circRNA 浏览功能区。2. 获得检索结果包括相关 circRNA 的 ID、circBase ID 和染色体位置等信息。3. 点击进入 lncRNA 和 mRNA 浏览功能区。4. 获得检索结果包括基因名、基因类型，相关 circRNA、表达等级和特异性表达组织等信息。二、搜索功能区使用1. 点击进入搜索功能区2. TRAF3 在不同类型样本中的表达线图。3. TRAF3 在不同类型样本中的表达热图。4. 点击获得 TRAF3 在

UCSC 是一个非常庞大的类似于 NCBI 的航母式网站，里面包含了非常多的信息，也有很多非常好用的小工具。简单介绍网址：https://genome-asia.ucsc.edu/index.htmlUCSC 是生物领域里常用的数据库之一，由 University of California Santa Cruz (UCSC) 创立和维护，主要包含了人类、小鼠、果蝇等多种常见物种的基因组信息。UCSC 里也包括了一系列的分析工具，帮助用户浏览基因信息、查看已有基因组注释信息和下载基因序列等，用户可以通过它可靠和迅速地浏览基因组的任何一部分，并且同时可以得到与该部分有关的基因组注释信息，如已知基因，预测基因，表达序列标签，信使 RNA，CpG 岛，克隆组装间隙和重叠，染色体带型，小鼠同源性。一、查找某基因的具体序列信息1. 浏览器打开 UCSC 官网，鼠标放置于 Genome 位置，若想查询人类基因则点 Human GRCh38 /hg38，若想查询小鼠基因则点击 Mouse GRCm38 /mm10。在此我们以查询人类基因中的 lncRNA CASC15 为例进行介绍。2. 点击 Hu

说起基因组序列数据库，大多数人耳熟能详的是三巨头GenBankEBIDDBJ这些数据库在设计之初虽然考虑了基因组存储的需求，但在基因组分析和数据挖掘上的功能设计则比较欠缺。而 IMG/M 作为新一代基因组数据库的代表，不仅能够完整收录现有数据库的内容，还提供了更完善的数据上传、注释和分析服务，将测序数据储存到 IMG/M 数据库（即将 IMG/M 数据库的登录号填写到文章中）也是被许多顶尖期刊如 Nature Communication 所接受的。IMG/M 数据库接受上传纯培养测序基因组、宏基因组、宏基因组组装基因组（Metagenome-Assembled Genome，MAG）、单细胞测序基因组数据，而且它们的上传步骤是相似的。这里我采用并行的方式演示 IMG/M 数据库中各种数据的上传。此外上传到 IMG/M 数据库的宏基因组数据会自动进行分箱（Binning），组装出样品中单菌的基因组。信息填写1、首先登录 GOLD 主页：2、点击 Register，进入登录页面，点击 Create a new Sequencing Project in GOLD（创建一个新测序项目），选择

确定一种蛋白质的结构和功能是现代生物学许多研究的基础。在过去的几十年里，人们开发了许多用于结构预测的计算工具，其中 Phyre2 因其强大的分析能力与简单的操作被生物科研人员广泛使用，据统计每天都有约 1000 个任务提交到 Phyre2 服务器上。Phyre2 分析能力强大，结果界面丰富直观，可以预测和分析蛋白质的结构、功能和突变。相比之前的版本 Phyre v 1.0，Phyre2 使用更先进的远程同源检测方法来构建蛋白质三维模型，预测配体结合位点，并分析氨基酸突变（如 SNPs）对目标蛋白序列的影响。接下来让我们一起来感受下。登录 Phyre2 主页 （http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2），复制并粘贴目标氨基酸序列到框中。填写提醒邮箱。选择 Normal（普通）或 Intensive（强化）模式。提交任务后页面会显示任务进度和预测所需时间。提交 Phyre2 任务结果页面页面分为几个主要部分：总结、序列分析、二级结构预测、结构域分析和模板的详细信息。在某些情况下结合位点预测和跨膜螺旋的预测。1. 序列分析：点击「查看 PSI-Blast 多序列比