大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆 和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性(因而它是唯一适合遗传物质的)，但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质(因而它具有执行众多生物学功能的用途)。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达(overexpression)，表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%(一)试剂准备采用T7· Tag Affinity Purification Kit1.

大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。 分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA 克隆 和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA 序列具有异乎寻常的多样性(因而它是唯一适合遗传物质的)，但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质(因而它具有执行众多生物学功能的用途)。 正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化，但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier 等发展的以噬菌体T7RNA 聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达(over-expression)，表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。 一、

通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。 当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。 以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。 1.准备工作（试剂配置和器材准备） 1)操作流程示意图 主要步骤操作 ①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收 ②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收 ③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接，转化 ④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株 ⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白 ⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除

Logistic 回归：实际上属于判别分析，因拥有很差的判别效率而不常用。 1． 应用范围： ① 适用于流行病学资料的危险因素分析 ② 实验室中药物的剂量-反应关系 ③ 临床试验评价 ④ 疾病的预后因素分析 2． Logistic 回归的分类： ① 按因变量的资料类型分： 二分类 多分类 其中二分较为常用 ② 按研究方法分： 条件 Logistic 回归 非条件 Logistic 回归 两者针对的资料类型不一样，后者针对成组研究，前者针对配对或配伍研究。 3．Logistic 回归的应用条件是： ① 独立性。各观测对象间是相互独立的； ② LogitP 与自变量是线性关系； ③ 样本量。经验值是病例对照各 50 例以上或为自变量的 5-10 倍（以 10 倍为宜），不过随着统计技术和软件的发展，样本量较小或不能进行似然估计的情况下可采用精确

E.coli 的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态. 在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 。 在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态.此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动. 当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导.在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身.乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖.后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用. 材料： 1、诱导表达材料： ( 1 )

嵌套 PCR 又称巢式 PCR（nested PCR,nPCR）,是指以第一次 PCR 产物为模板直接进行第二次 PCR 扩增，以增加 PCR 的灵敏度，第二次 PCR 设计的引物在第一次所用引物对的内部，这种引物被称为「内部」或 「嵌套」引物。 以第一次 PCR 产物为模板进行第二次 PCR 扩增，可明显提高敏感度而对特异性无损（Albert and Fenyo 1990)。 由于嵌套 PCR 使用两套引物对，在补充反应组分如 Tag DNA 聚合酶后就可能提髙总循环数。如果不能进行完整的嵌套 PCR (使用两个内部引物），为提髙灵敏度和特异性，可设计半嵌套 PCR，即只用一个内部引物，与来自第一次反应的外部引物结合使用。 嵌套 PCR 的最大问题是它易受污染。必须将第一次 PCR 的反应管打开，将初级产物转移 到新管，以进行第二次反应。其缺点也包括进行两轮 PCR 需要额外成本和额外进行引物合成。 为了降低污染风险，可使用一种被称为 drop in/drop out 嵌套 PCR 的单管 PCR 方法。 在该方案中，设计的内部引物的解链温度显著低于外部引物对。两

正在着手做 real-time PCR 的朋友们，我想最开始肯定要考虑引物设计的问题。看完下面的文字，我保证你得到想要的引物设计方法和引物序列。第一步：拿到你所要研究的基因的序列。不要告诉我你不会找序列。如果真的不会，请参考丁香园内其他版块，如NCBI使用，序列查找等。第二步：确定你想用哪种方法。Taqman Probe 还是 SYBR 染料？两种方法各有利弊，这里不赘述，不明白的依然参见其他版块。但需要指出的是，后者在国内更常用，因为比较简单，容易操作，容易分析。建议初学者选择。第三步：动手设计引物1）两种引物设计软件。在设计 real-time PCR 引物时，常用的有非常 NB 的 primer premier 5.0 和 primer express 3.0 (升级版有5.0)。前者可以应用与常规PCR和real-time PCR；后者是ABI公司的real-time PCR仪器配套的引物设计软件，专门为real-time PCR设计。2）选择哪个软件合适？在第二步中，我已经说过，你要先确定你选择哪个方法。如果你想用 Taqman Probe 法，请你选择 primer exp

总的说来，荧光检测技术可大致分为两大类：通用型的荧光染料检测法和高特异性的荧光探针法。 前者主要是利用荧光染料(如SYBR Green I)与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针 ，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量 PCR 仪，缺点是专一性不如探针法； 而后者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于扩增序列专一检测(见下表)，不过增加了荧光探针的成本。 除了以上这些，还有双探针系统(bi-probe system)、BODIPY FL标记探针、Light- up探针、iFRET(induced fluorescence resonance energy transfer) 技术、Qzyme 探针和Magiprobe等等。 这么多种荧光标记方法，在选择的时候当然要根据各人实验设备、实验目的以及实验要求，还有经费来判断了。 荧光染料 对于专一性要求不高的实验，或者是大规模高通量的实验，使用方便、花费较小的荧光染料可以作为你初步的选择对象。老实说，荧光染料

多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。这项技术非常有用，他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高 DNA 样品的利用率。 另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。多元 PCR 和组合 PCR 往往被当作同义词使用。 设计策略 MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一是反应中，每另加入一对引物会导致一定程度的灵活性的丢失。引物数量的增加也使引物二聚体和非特异扩增出现的概率增加。因此，进行多元 PCR 要求周密计划，且需多次尝试，使反应条件优化。 理论上，一个多元反应中，所有引物扩增其特异序列的效率应该是一样的，但通常是很难预测一对引物的效率。在相似条件下，退火温度几乎相同的寡核苷酸可更好地工作。 多元 PCR 引物设计和优化的一般规律 当设计 MPCR 引物时，除了引物设计的一般规律外，其他一

除了为克隆基因、预测编码蛋白而需要研究基因的构成外，当前在基因组学上的努力也包括对基因组构成的研究，以分析具有结构和调控因子插入的基因。近源物种分析成为比较基因组学的主要内容，被认为是研究进化、基因功能和人类疾病的重要方法。 利用该方法分析微生物，特别是细菌的基因组，早在 1996 年就已开始识别出细菌中的保守基因和与亚种相关的毒性基因（Fredricks and Reiman 1996)。这方面的进展促生了新的、大规模的检测和识别致病菌的方法。近源种 PCR 可以用来研究进化上相关的种，它们在基因组上有一 些共同的特点，这些保守的区域可被用于在基因组水平识别新种。还可以用该技术在尚未测序的物种的基因组中扩增同源基因。 设计策略 根据多元序列比较和引物设计的一般规律来设计近源种 PCR 引物。通过比较少数几个大的相近序列识别出保守区域，这些区域即是近源种引物的可能结合位点。近源种的比较需要对少数大的相近序列进行精确比对，通过比对找到保守区，作为可能的近源种引物的设计位点。 引物向保守区的退火可被用于在不同种中扩增同源位点（见图 1)。应遵循以下步骤。 图1

设计策略 PS：该方法适用于检测或部分 DNA 片段克隆，不适合全长基因克隆 反转录 PCR 的主要问题是基因组 DNA (gDNA) 污染的存在，这将导致产生假阳性信号，特异性降低或对特定 RNA 的过高估计。为了消除 RT-PCR 中 gDNA 的干扰，可将引物设计为与两个外显子的接合部退火，该点为 cDNA 序列专有，因此 gDNA 将不能被扩增。 cDNA 特异的引物可通过三个途径设计（如下图所示）。 cDNA、gDNA选择性引物设计原理图 1. 引物横跨外显子-外显子接合部。设计的引物如果一半与一个外显子的 3'端结合，而 另一半与相邻外显子的 5'端结合，它将只与 mRNA 或由已剪切的 mRNA 合成的 cDNA 退 火，而不与 gDNA 结合，因而可以避免对 gDNA 污染的扩增。正向或反向引物都可设计为 横跨外显子接合部；而另一个引物可设计为结合于另一个外显子接合部或在完全位于外显子 内部的位点上。 2. 外显子完全配对-内含子交叉配对引物。为了从 cDNA 和 gDNA 混合物中选择性地扩增 gDNA, 设计的引物应与外显子-内含子

开发实验设计助手的Nathalie Percie Du Sert 图片来源：Welcome Trust 应该有一种免费在线工具，可以让动物实验设计可视化，并提出重要的反馈，这样可以把科学家从糟糕的研究设计歧路上拉回来。这正是一些软件研发者所希望的目标。 过去几年，研究人员在发表的动物研究成果中挑选出大量的设计和报告错误，他们指出这些可能会导致偏见。作为回应，数百家期刊就报道动物研究论文达成自愿性指导规则，形成最佳操作实践清单，如利用什么样的统计计算避免错误。 但是这些清单在科学家递交稿件后才会发挥作用，英国伦敦更换、细化和减少动物研究国家中心实验设计专家Nathalie Percie du Sert说。“如果已经到达汇报阶段，事情就晚了。”她说，“我们希望研究人员在设计阶段就考虑到这个问题。” Percie du Sert的解决办法是一个叫作实验设计助手（EDA）的软件，该软件在2015年10月开始启动。她希望这款软件有助于提高动物研究质量，甚至可能成为动物研究不可分割的一部分。 EDA可以让科学家通过关键元素，如用假设、实验方法和分析计划进行逻辑关联

细胞培养技术中，细胞计数是一项基本功，对于标准化培养条件以及需要精确定量的实验来说都非常关键。这里介绍使用血细胞计数器对细胞进行计数的经典方法以及中间一些需要注意的细节。 制备细胞悬液： 对于贴壁生长的细胞，我们需要首先使用胰酶消化的方法使细胞从培养皿表面脱落 根据需要加入合适体积的培养基，将细胞进行中和及稀释，以得到均质的细胞悬液。要求尽可能将细胞吹打散开，不要残留任何细胞团 准备血细胞计数器： 使用70%乙醇将盖玻片和血细胞计数器清洁干净 将将盖玻片润湿（使用水或呼一口气，目的是使盖玻片与血细胞计数器接触更紧密，易于粘连），并覆盖至血细胞计数器上 台盼兰染色（可选）： 如果需要计算细胞的活力，则需要将细胞悬液和0.4%台盼兰等体积混合 室温孵育3-5分钟，使台盼兰完全进入死细胞，使死细胞着蓝色 血细胞计数器加样： 使用吸管将细胞悬液或细胞/台盼兰混合液滴加到血细胞计数器计数池的边缘。此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池 以同样的方式在另一侧的计数池中也加入细胞悬液 将计数板放置几分钟使细胞完全扩散，同时用吸水纸吸除多余的液体 细胞计数： 在1

写在前面： 一直都像个新手，从未老道过。所有新手的迷茫与无奈我最能体会。看到园子里有一些同学在问有关CCK8试验的事情，当初我也和他们一样，像个被蜘蛛丝缠住头的迷茫苍蝇一头扎进园子里，期待能找到些解决谜团的只言片语。希望我写的这些非专业文字能够帮助那些在实验室里没有前行者指点迷津的筒子们。当然仁者见仁智者见智，我写的只是个人实验心得，仅供参考。欢迎大家拍砖共同进步。实验是简单的，道路是曲折的，时间就是用来浪费的，科研就是自娱自乐使劲折腾。 我没有做过MTT实验，但其实原理及目的都是一样的（反应机理不一样）。都说CCK8简单点而且数据更稳定，所以就用了这个试剂盒。 CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。摸条件包括：1、种板数；2、种板后细胞的贴壁生长时间；3、加药后的孵育时间

1. 引言 如果酶能够被改造使得其稳定性得以提高，它将会得到充分的开发利用。例如，酶能够在比较大的温度范围内具有活性，或者对蛋白酶的敏感性降低从而半衰期得到延长。蛋白质稳定性的提高，如同增加其特异性和反应活性一样，在工业和制药业中是最受关注的特性之一。 目前为止，发现了很多提高蛋白质热稳定性的因素 [ 1~4 ] 。例如，刚性和紧密程度的增加，更多的疏水残基在核心中的引入，以及范德华作用力的增加。此外，蛋白质的热稳定性还可以通过引入金属结合位点或额外的二硫键 [5，6] 、主链环化以及缩短或删除环区等步骤来提高。决定蛋白质高热稳定性的两个主要因素被认为是氢键增加和离子键网络的形成 [ 8~10] 。 然而，由于分子水平上对蛋白质热稳定性仍未有完整的认识，把蛋白质改造成热稳定性高的蛋白质仍然是个难题[ (11 ] 。计算和比较研究法用于识别其稳定作用并已经成功地加以应用 [ 12~14 ] 。然而它们必须依赖于有良好分辨率的晶体或核磁共振结构。结构中能清楚地看到 Cα 的轮廓，并且能获得许多同源序列，最好是嗜热来源的。此外，模拟达尔文优化循环“突变、重组和选择”的进化方法也被用来突

超净工作台在当今医学、生物科学、食品科学和电子科学等研究领域中已经成为一种必不可少的实验室设备。科学家们需要超净工作台来提供一个洁净的，无尘的试验环境，来保护昂贵的样本不会受到污染，以及危险的样品不泄露到周围环境中。超净工作台正是为了满足用户这方面的要求而出现的。现在市场上存在各种品牌、各种型号的超净工作台，怎样才能选择到满足自己需要的而且花费最少的超净台呢？怎样才能最大限度的使用超净工作台，保护好你的投资？以下是笔者对超净台选购、使用和维护的一些建议，希望对各位有所帮助。超净工作台的工作原理超净工作台由三个最基本的部分组成：高效空气过滤器，风机，箱体，仅仅以上三部分，就可以构成一个超净工作台，当然，这样的产品不会有人购买，所以制造商会给它装上很多辅助系统，有些很有用，有些很无聊。超净工作台分为两种，一种是垂直流的超净工作台，即工作区域的空气流动方向是垂直的，另一种是水平流，即空气是水平流过工作区域的。一般多见的是垂直流的超净工作台，所以本文主要介绍垂直流超净工作台。对超净工作台而言，最主要的就是空气循环过滤的过程，这就是一切超净工作台为达到洁净目的采取的基本手段，在这个过程中，风机起

计算支原体的菌数不能用血球计数板、比浊法等，需要采用菌落形成单位（CFU）计数法或者颜色改变单位（CCU）测定法。这两种计数法都需要几天才能出结果，也就是原来待测菌液的菌数。请问如何将该菌液保存下来，以便接下来的定量共同培养、抗药等实验？如果是直接将菌液放到－20度或者－70度冰箱保存，直到需要的时候再溶解，那么冻存过程中肯定有一定数量的支原体死亡，解冻后的菌液菌数也许远低于测定值CCU/CFU吧。是否需要加入甘油或DMSO作为冻存保护剂。是否有一种公认的常规的方法来做加入定量支原体的实验呢？首先，支原体保存可以用甘油！支原体定量确实是个难题，我觉得有个方法可以解决你说的冻融问题。在相同条件（温度、时间、保护剂浓度、培养基）下，冻融一次的死亡率应该是恒定的，因此你在冻融前后都定量一下，计算死亡率是多少，以后每次冻一大批，测冷冻之前的量就可以了。当然，以我的经验，冷冻时间长短对支原体有一定影响，但影响不大，半年之内都没问题吧。一般来说支原体的培养是无法计数的，由于其太小了，所以用ccu（colour change unit） 来表示 ，具体的实验判别手段也是依据其颜色的变化，但是不知道大

9月19日，HORIBA Scientific举办了光谱应用系列在线讲座（1）——“光谱仪在生物/生命科学领域中的应用”。涉及：荧光光谱、拉曼光谱、SPRi表面等离子体共振成像三大技术，吸引了众多师生的参与。在讲座过程中大家也就自己在学习或工作中遇到的困惑踊跃提问，但由于现场时间有限，有部分问题没来得及作答，现整理后供大家参考。 1：拉曼光谱技术Q：不同的波长激发，同一物质的拉曼峰会偏移吗？A：会。对于大部分物质来说，不同的激发波长不会对拉曼位移产生影响，但是有一些特殊的物质如石墨烯的2D峰，是双声子共振二阶拉曼峰，连接声子波矢量和电子能带的双共振过程使得2D峰频率极易受激发光波长影响。 Q：偏移不是与激发波长无关么?A：有些特殊的振动会受激发波长的影响，可参见文章“Raman Spectroscopy of Carbon Materials:Structural Basis Of Observed Spectra”, Y.Wang, D.C Alsmeyer and R.McCreery, Chem.Matter, 2, 1990. Q：拉曼成像跟荧光流式有什么区别和特色？A：两者的

1. 引言 噬菌体展示是一项改造结合靶分子多肽的强大技术 [ 1 〜 3] 。蛋白质与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白，可以在噬菌体表面表达，而相应的编码基因则包裹于噬菌体颗粒内 [4] 。包裹的 DNA 通过突变扩增构建噬菌体展示多肽库，为筛选各种变异体做准备。通过固定化靶分子体外结合实验，高亲和力的蛋白质可以从蛋白质展示库中筛选出来。随后，选定蛋白质的序列可以通过 DNA 测序推断出来。 靶蛋白可以通过构建噬菌粒载体与主要衣壳蛋白 [ 蛋白质-8 (P8) ] 或次要衣壳蛋白 [ 蛋白质 -3 ( P3 ) ] 形成的融合蛋白在 M13 噬菌体表面以低拷贝方式展示，这需要在野生型（wt) P8 和 P3 辅助噬菌体帮助的条件下进行 [5] 。由于融合蛋白的展示水平随蛋白质序列和长度的不同而不同，多价蛋白与 P8 融合进行展示难以实现 [6] 。例如，如果 P8 的每一个拷贝都与展示多肽形成融合蛋白（噬菌体系统，而不是噬菌粒系统），融合多肽长度超过6 个氨基酸残基，噬菌体一般就会不稳定 [7] 。即使在噬菌粒系统中，蛋白质展示也高度依赖于蛋白质的大小和性质 [8]。尽管用 P3 或

1. 引言 众多研究结果表明，天然蛋白质结构对于氨基酸的替换具有非常显著的“耐受性”。因此很多不同的氨基酸序列可以编码产生给定的三维结构 [ 1~7 ] 。 我们利用这一 “耐受性”来发展蛋白质设计的总体策略。这一称为 “二元码”的策略是基于极性与非极性氨基酸适当的组合能指导多肽链折叠成相应的二级结构元素，同时使得包埋的非极性氨基酸形成所需的三级结构 [ 8~10] 。设计的 “二元组图” 利用了蛋白质二级结构中天然具备的周期性：α 螺旋具有每圈 3.6 个残基的重复周期性，而 β 股（β-strand ) 具有交替周期性（图 9.1)。因此，设计为双亲性 α 螺旋的二元组图序列应该在第三或第四位放上非极性氨基酸。相对应，设计一个双亲性 β 股应该在序列中交替安插极性和非极性氨基酸残基。在 “二元码” 策略中，蛋白质侧链的精确三维堆积并不需要预先确定。因此，在一个二元组图序列库中，每一个极性和非极性残基的侧链可以变化得非常剧烈，从而产生巨大的组合多样性。 二元组图蛋白质的组合库是由合成基因的组合库表达出来的。每个基因编码一个不同的氨基酸序列，但是在同一个给定组合库中的所有序列具