1. 前言 蛋白质芯片包含几百甚至几千个已知的蛋白样品，这些蛋白样品有序、高密度排列在镀膜玻璃板上。利用这些蛋白质芯片可以对蛋白质的表达 [5~7] 和修饰 [ 8~ 11] 进行平行、快速和简易的分析，同时也可以用来检测这些蛋白质与抗体、其他蛋白 [ 16，17] 、DNA [ 18，19 ] 或其他小分子 [ 20，21 ] 之间的相互作用。已有一些研究工作使用蛋白质抗原芯片分析特异性抗体 [ 12，15 ] 或从患有不同疾病的病人中筛选血清 [ 15，22，23 ] 。蛋白质组芯片作为 一种理想的分析特异性抗体的格式被人们所重视 [13] 。为了在单个蛋白质芯片上分析几 种不同的抗体，可能需要运用不同的方法 [ 24，25 ] 。与 Western 印迹相比，运用蛋白质芯片分析抗体有一些优点 [13]，其中包括高灵敏度的蛋白质检测 [13，23] 。 蛋白质组学方法，如 2D 电泳/质谱（2-DE/MS ) 方法或是蛋白质芯片技术，在植物学领域中的应用越来越多 [ 26~32 ]。在此，我们介绍一种构建植物蛋白质芯片以及利用蛋白质芯片研究抗原抗体相互作用的方法。我们已成功地运

1. 前言 与其他真核细胞一样，植物细胞中，糖基化通常发生在分泌蛋白质上，虽然在细胞质蛋白和核蛋白上也发现一些糖基化反应。根据寡糖部分和蛋白质骨架之间的连接方式，可将糖基化分为两种类型：N -糖基化和 O-糖基化。植物中 N-糖基化研究最多。 1.1 N-糖基化 与其他真核细胞一样，在植物细胞中，N-糖基化只发生在进入分泌途径的蛋白质上。它从内质网中的寡聚糖前体 Glc3Man9GlcNAC2 共翻译转移到构成初生蛋白质 ( Asn-X-Ser/Thr，X 可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意一种氨基酸）N--糖基化序列的特异天冬酰胺残基上开始，当新合成的蛋白质进入内质网腔后就发生 N 端序列糖基化反应（图 25-1B )。接着，当糖蛋白从内质网经高尔基体到达其最终目的地时，Glc3Man9GlcNAC2 前体沿着分泌途径进行进一步加工处理。如果糖基侧链能被内质网和高尔基体中的糖苷酶和糖基转移酶加工的话，Glc3Man9GlcNAc2 前体就会被成功转化为 Man9GlcNAc2 和 Man5GlcNAC2 范围内的髙甘露糖型 N-聚糖（图 25-1A)， 以及复杂形式的 N-聚

1. 前言 蓝绿非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN- PAGE) 最先由 Hermann ScMgger 开发出来，并被用于优化线粒体和细菌的膜结合蛋白质的分析和鉴定。这种方法的最初理念是在电泳之前，先将蛋白复合物与蛋白质染料考马斯亮蓝混合在一起。在中性 pH 点上，考马斯亮蓝是一种带负电荷的分子，这时它可将负电荷引入到蛋白质复合物中。与十二烷基硫酸钠（SDS) 的作用相反，那些负电荷不结合到去折叠或解体的蛋白质复合物上。如果考马斯亮蓝渗透进去的蛋白质组分能在低百分浓度的聚丙烯酰胺凝胶上被分离，那么蛋白复合物的亚基就会在 SDS 存在的情况下，通过第一相的 BN-PAGE 电泳和第二相的 SDS-PAGE 电泳被分离出来。在 2D 凝胶上，蛋白点沿着竖条排列，便于指认这些蛋白复合物。第一相凝胶能分离天然状态下的蛋白质和蛋白复合物，并可用多种 胶内染料染色，BN- PAGE 对分离膜结合蛋白复合物特别有用，因为这些蛋白复合物常常缺乏用电泳方法分离天然蛋白质所必需的内部电荷。制备膜组分样品时，需要在考马斯亮蓝染色前，添加去垢剂来增溶膜蛋白，一般使用与天然蛋白质条件一致的温和的非极性去垢剂。B

1. 前言 蛋白质组学分析是一个多步骤的过程，通常涉及蛋白质的提取、分级、分离和质谱鉴定。分离蛋白质的首选是二维电泳。胶内消化、纯化的蛋白可以利用 MS 或 MS/MS ( 串联质谱）得到的肽段进行分析、鉴定。如果已知物种的基因全序列，则通常使用基质辅助激光解吸质谱法电离飞行时间（MALDI- TOF) 的 MS 光谱技术来进行分析。它是一种高通量鉴定蛋白质的方法，而且也不需要纯化肽段。另外，尽管 MS/MS 分析比较费时，但可以在没有数据库（从头测序）情况下识别单个肽段。理论上，利用 MS/MS 鉴定出的一个肽段就可足以找到相应的蛋白质，而实际上利用 MS 鉴定蛋白则至少需要 4 个或 5 个肽段和肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting) 。在只有不完整的序列数据库 [ 如只有表达序列标签（EST ) 数据库 ] 或只有其他物种的保守序列用于识别时，MS/MS 具有较大的便利性。与二维电泳相比，提出了另外一种简单水解蛋白质混合物的方法而不需要分离蛋白质：利用多维液相色谱（LC ) 和 MS/MS 用于分离复杂混合物和识别数千条多肽片段。这两种方法之

1. 前言 鉴定植物磷酸化蛋白质的实验方法主要有以下 5 种 ：① 放射性同位素 32P 或 33P 标记 [1]；② 不同蛋白质电泳迁移率的检测 [ 2，3] ；③ 磷酰氨基酸特异性抗体的免疫分析[ 3，4]；④ 磷酸化诱导增加的完整蛋白质质量的质谱分析[5，6] ；⑤ 蛋白质水解后得到的磷酸肽的鉴定及序列分析 [ 7~9] 。最近已经报道了以上所列的此种技术用于检测植物类囊体膜上磷酸化蛋白的实验方法[ 10] 。因此，本章将不再进一步讨论以上 ①~④ 的实验方法，重点讨论最有效率和最有用的第 ⑤ 种实验方法。 这一技术基于蛋白质组分的胰蛋白酶消化以及肽段（不是蛋白质）的进一步分离，蛋白质的水解消化应该在不同的膜分离制备物或植物细胞可溶性组分中进行。通过固相金属螯合亲和层析（IMAC) 富集得到的肽混合物中的磷酸肽，用串联质谱对分离到的磷酸肽进行序列分析。这种方法能识别体内磷酸化蛋白质及其蛋白质序列磷酸化的准确位点。该方法对最近完成的植物以及其他物种中蛋白质磷酸化位点定位图作出了主要的贡献 [11] 。 这种方法关键部分就是磷酸化肽段的质谱序列分析。一旦蛋白质磷酸化位点被定位，接

1. 前言 聚丙烯酰胺双向电泳 [1] 和质谱分析是分离一个组织中的蛋白质（2D 电泳图谱)以及鉴定差异蛋白表达的有用工具。 一个典型的蛋白质组实验会得到几张双向电泳胶板和相应的几百甚至几千个蛋白质点的图形、定位和定量数据及其质谱信息。最后数据必须综合、比对转化成生物学假设，这项工作并不轻松，因为它包括了许多不相干的技术和方法以及大量的数据。 开发 PROTICdb 数据库是为了处理植物蛋白质组学中从 2D 聚丙烯酰胺电泳和质谱分析得到的所有数据 [5] 。该数据库可以自动建立与外部序列数据库的链接，并用基因本体（GO) 术语注释蛋白质，为用户提供一个链接公共功能信息的接口。那些对学者或数据分析有价值的，来自生物学家的，与蛋白质点相关的发现和结论可被存储在 PROTICdb 的知识库中。我们已经可以在两个蛋白质点之间建立二元关系，如匹配度、等位性和翻译后修饰。通过分析这些关系，PROTICdb 数据库能推断出新的关联，建立蛋白质点的网络，将鉴定数据从一个点扩展到相同蛋白质点网络中的其他成员，所以，当一个新的关联加入到数据库后，或许能完成之前实验得到的蛋白质点的注释。 http:

1. 前言 植物模式基因组测序和功能鉴定的研究成果以及快速增长的许多植物序列的数据 [1，2 ] ，使得用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI -TOF- MS ) 获得的肽质量指纹谱来鉴定蛋白质变得轻而易举。这种方法具有高灵敏度、高通量和低成本特点，但需要前期的蛋白质分离。由于膜镶嵌蛋白质在第一相的等电聚焦 （IEF ) 电泳中沉淀，目前最常用的以高分辨率解析从细胞中提取的蛋白质的二维凝胶电泳技术还不适于完全分离膜蛋白质组 ( 见第 11 章），相比之下，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳可有效分离膜镶嵌蛋白质。 下面要介绍的方法是以离子交换层析替代 2D-GE 电泳中 IEF，如果样品量充足，还可以辅以凝胶过滤色谱层析 [7] 。最终用 SDS-PAGE 电泳进一步分离膜镶嵌蛋白质。经过上述这些分离过程，许多膜镶嵌蛋白的胶内酶解和 MALDI-TOF/MS 分析获得了成功。 这个方法的目标之一是在一个单一的实验构架内，分离膜组分中不同类别的蛋白质，包括大部分的疏水、酸性和碱性蛋白。它们可通过染色胶和 MALDI-TOF/MS 蛋白质指纹谱进行蛋白质分析。本章节介绍的方法可

1. 前言 应用于复杂的肽复合物分离和鉴定的纳升级 2D 液相色谱串联质谱（LC-MS/MS ) 技术的发展，是近年来蛋白质组学领域最重要的进展之一 [ 1，2] ，这种技术通常被称为多维肽段鉴定技术（Mudpit) [3] 。该方法首先将复杂的蛋白混合物用一种蛋白酶（如胰蛋白酶）消化成一组大小不一的肽段混合物，然后用相互垂直的二维液相色谱分离这个肽段混合物，用这种二维液相色谱技术分离肽混合物不是各相液相色谱分离组分的简单算术总和，而是根据肽在各相液相色谱中的迁移特性，最终获得分离的肽产物组分 [ 4，5 ] 。 这个方法的优势是它不会有在 2D 蛋白凝胶电泳中常发生的由于蛋白质的极端大小，疏水性以及等电点等方面造成的偏差，而且这个方法可以在相对较短的时间内对于给定的样品获得大量的蛋白质鉴定数据。但是，这个方法也存在一些缺点，如技术要求高 ，重复性不好，因此它不适合分析蛋白表达量差异微弱的两个样品。最近有研究报道[ 6，7] ，通过利用 N15 代谢标记生物体，如酵母和大肠杆菌，进行多维蛋白定量分析两个细胞状态间的蛋白质表达的变化。但是，这种方法只能用于能被 N15 代谢标记的生物

1. 前言 值得注意的是，蛋白质质谱（MS) 鉴定是在 20 世纪 80 年代后期基于 “ 软” 电离技术发展起来的，这些电离技术包括欧洲 Michael Karas 和 Franz Hillenkamp 开发的基质辅助激光解吸电离（MALDI ) 和美国 John Fenn 开发的电喷雾电离（ESI )。JohnFenn 和 Takana 由于开发了 “软解吸电离方法应用于生物大分子的质谱分析” ，而获得了 2002 年诺贝尔化学奖。 由于蛋白质提取物能充分分离和兼容二维凝胶的染色（见第 16 章和第 17 章），因此适合于通过 MS 进行蛋白质鉴定。然而，整个蛋白质的 MS 不等于蛋白质的直接鉴定。要达到灵敏度高、准确度好并能访问大部分数据（ 覆盖序列），蛋白质必须由内切蛋白酶（endoprotease) 消化产生多种蛋白质的特定片段。如果内切蛋白酶有足够的特异性、数据库中有蛋白质的信息，则通过对实验样品肽质量（由内切蛋白酶消化产生、通过 MALDI-TOF 质谱检测）与数据库中所有蛋白质硅片消化的肽质量的推断比较，就能对候选蛋白质进行鉴定。 植物蛋白质组学使用的技术类似于其

1. 前言 蛋白质组学的一个主要研究技术是高分辨率的二维凝胶电泳技术（2-DE ) 。这项技术通常运用一维的电荷分离蛋白（等电聚焦）和二维的分子质量分离蛋白 （SDS-PAGE) 。一个二维凝胶系统的上样量可以达到毫克级并且可以分离数千个蛋白质点。虽然这项技术运用非常广泛，但是还是有一些技术上的限制。由于实验条件及主要蛋白溶解度的微小变化，在一个 2D 凝胶上的蛋白质表达模式不能准确地重复。这使得要精确研究蛋白质表达差异时的微小变化非常困难，并且要精确定量蛋白质含量的微小变化将更加困难。运用不同的程序软件比较分析在相同凝胶上的不同样本尽管可行，但要精确比较蛋白质点，需要对大量的图片进行处理和分析。可用的、有限的高动态蛋白标记技术及上述方面限制了二维蛋白质凝胶电泳中蛋白质点的分析速度和准确定量。 2D-DIGE 技术 [7] 是在 2D 凝胶技术的基础上增加了一个准确定量的元件。它可以在比较多个样本的蛋白质丰度变化的同时，对置信度进行统计学分析 [ 8，9] 。比较蛋白样品时是先用蓝色荧光染料标记，然后再混合，最后在相同的 2D 凝胶中进行分离。这样消除了蛋白在不同凝胶上的漂移，因此

1. 前言 很明显，在实验中能提供大量信息的某项技术如双相电泳，是不适合用常规的统计学方法来分析的。如果一定要用常规的统计学方法，通常含有大量蛋白质点的一些 2D 凝胶就没有足够的自由度来分析。只有在研究蛋白质的上调或下调和有足够的样品时，才可以运用常规的统计学方法来分析。在正常情况下（有限的 2D 凝胶和大量的蛋白质点），想要快速找到感兴趣的蛋白质点，一般采用多元分析方法 [ 1，4] 。因此我们提出了一个新的涉及工作流程的多元分析方法，即产生假设的（hypothesis generating ) 而不是假设驱使的（hypothesis driven ) 。这样，我们就能灵活自由地开发数据而不产生偏差，而且最终能运用生物学知识建立相关的假设。 产生假设的分析是多元分析背后的整个概念的一个自然结果。传统的统计学分析往往是先建立一个假设，然后用实验来证明或推翻这个假设，也即是我们所谓的演绎分析。相对于传统的统计学方法，多元分析是一种归纳分析。因此假设是在一系列的计算实验之后建立的。 多元分析以统计学和数学方法为基础，包括一些可视变量的数据分析及一些具有许多重要变化形式的体系研究

1. 前言 揭示在不同生理、发育或遗传法则背景下发挥不同生物功能的蛋白质量的变化是比较蛋白质组学研究的重要内容。大多数研究基于对蛋白考马斯亮蓝或银染二维凝胶电泳的比较。尽管人类双眼对凝胶上的点有很强的分辨能力，大部分预期蛋白质的变化可以定量，但这种用于定量评估的方法仍显得相对粗糙。不能顾及到超过二或三倍强度的种类 ，甚至若没有可以揭示多个凝胶中有统计意义上差异的软件帮助，连简单的实验设计也不可能。目前已经开发出了用于检测、定量和匹配相应蛋白质点的几个软件。本章的主要目的不是对比不同软件产品，而是将注意力集中在不同蛋白点的图像采集和实验设计上，因为获得髙质量的数据和设计出不同程序进行初步数据分析，才是我们需要关心的。尽管多数二维凝胶专用软件提供有统计分析工具，但比平常的统计软件包有更多的限制，在此不作详细解释。事实上，一旦蛋白质点已正确量化和匹配，对它们可以像分析任何其他变量一样进行分析，并且有必要用像 SAS 或 R 统计软件包提供的多重功能进行分析。

1. 前言 如能通过电转移或其他相关技术将蛋白样品从凝胶相有效转移到适合于气相测序 ( gas-phase sequencing) 的其他介质上时，则 2D 凝胶分离的蛋白可进行 Edman 测序 [1] 。首先，皮摩尔数量级的蛋白通过 2D-PAGE 分离 [2]，然后经电转移从 2D-PAGE 凝胶上转移到 PVDF 膜上，再通过 Edman 测序法进行蛋白质的氨基酸测序。蛋白质 N 端顺序测定法—— Edman 降解是非常灵敏的测序方法（只需 1~5 μg 的蛋白质）。但是当出现缺口或模糊序列时，可以通过其他的方法来确认序列，而这往往需要更多的材料。 蛋白往往会进行翻译后修饰。N 端肽段封闭是较为常见的蛋白修饰之一。蛋白 N 端封闭既可以在体内也可在体外进行。但蛋白质抽提、2D-PAGE 和印迹可以防止这种 N 端封闭。使用非常纯的试剂，在抽提缓冲液、电泳和电转移缓冲液中加入自由基清除剂——巯基乙酸和进行预电泳以去除凝胶中的自由基清除剂都能有效阻止体外蛋白 N 端肽段的封闭 [3] 。然而，如果蛋白质的 N 端肽段在体内已封闭，则需用化学试剂、酶去封闭程序或者肽图谱程序来确

1. 前言 从 20 世纪 70 年代晚期以来，人们在不同的植物组织、器官、亚细胞结构和细胞器中开展了众多的寻找基因组表达差异（蛋白质组一词首次于 1994 年提出）的工作，以此来分析内部或外部刺激对蛋白表达模式的影响，如响应不同激素、化学药品或生物/非生物胁迫 （如热、冷 、干旱或臭氧），或是以此监控植物中不同生长发育阶段（ 如种子萌发、成熟或衰老) [ 1~5 ] 。 除了研究由特定基因组表达产生的蛋白质组的变化外，不同基因组产生的蛋白质组的差异也被广泛的分析 [2] 。例如，根据对蛋白表达定性和定量变化的简约分析，人们评估了种群内部和种群之间的系统进化关系和遗传距离并用来建立遗传图谱和系统进化树 [6] 。另一种应用包括为了区别和鉴定关系相近的株系、品种 [7] ，杂交后代或突变体而进行的遗传多样性评估。第三个研究领域是鉴定质量相关的分子标记（ 如烘培、麦芽制造和酿造质量[8] ) ，对植物病原（如真菌和病毒）的敏感性/抗性的标记和为植物育种定位数量性状基因（QTLs) [9] 。在最近的研究中，研究范围不仅扩展到对病原的研究，而且扩展到植物和共生微生物互作（ 如豆科植物和固

1. 前言 以双向电泳为基础的蛋白质组学研究中，蛋白质的溶解是一项艰巨的任务。举例来说 ，蛋白质必须达到它们的 pI，并且在这个 pI 保持可溶性，pI 也是溶解度的最低限度。此外，当蛋白质接近它们的 pI 值时，蛋白质的流动性下降，在强烈的电场中 ( 200 V/cm，与用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 10~20 V/cm 相比并不罕见）蛋白质进行等电聚焦（IEF) 。反过来意味，一般的盐类和离子化合物在 IEF 中几乎被排除。此外，在 IEF 之前使用的任何溶剂，不得改变蛋白质原有的 pI。因此，这排除了使用强离子去垢剂如 SDS。然而，少量的[ 0.03% ( m/V ) 以内] 离子去垢剂还是可以用，提供 SDS 与其他非离子去垢剂相互交换的条件，这确保去除了与蛋白质紧密结合的 SDS，但在等电聚焦过程中 SDS 的用处也损失了。因此，建议在 IEF 之前蛋白样品彻底溶解之后作用 SDS。 抛开这些由于蛋白质自身性质而产生的问题不说，许多生物样品中存在的问题源于样品中存在的非蛋白类化合物。典型的例子是，核酸浓度过高时完全模糊了双向电泳图谱 [4] 。核酸在低离子强度

1. 前言 植物质膜（PM ) 调控着细胞与环境之间的信息和物质交流。这种界面的位置赋予 PM 蛋白在细胞活动中的关键作用，如信号转导、代谢、离子运输和内吞，以及对病原体的反应和细胞壁融合，这些都是具体的植物职能。细胞膜物理化学性质的不同是它们分离的基础。质膜可以根据三大程序纯化。 ( 1 ) PM 与其他膜之间大小和密度的不同是用于分离的一个特点。该步骤需要对微粒部分进行连续或非连续的密度梯度离心 [1] 。 ( 2 ) 自由流电泳程序利用细胞膜的电荷来分离细胞膜 [2] 。PM 比其他膜带更多的负电荷并且因此可以有效地跟其他细胞膜分离。但这种做法需要一个特殊的自由流电泳仪装置。 ( 3 ) 用两相分离法分离 PM 部分依赖于膜囊泡之间不同起源的表面特性。这一技术潜在的原则是众多的水溶高分子质量的聚合物超过一定浓度不相互混合，而是形成分离相，每个分离相包含 85% 以上的水。这种含聚合物的分离相很适合做生物分析材料。根据不同的表面特性加入的膜在水性聚合物相之间被分离这项技术最初由 Laesson 等 [ 3 ]描述，现在由于它实现了 PM 蛋白的高产和没有其他内膜污染，已被广

1. 前言 通过电泳分离蛋白是蛋白质组学研究中常用的方法，因为其分辨率较高，有强大的进行凝胶对比的图像分析软件，并且与质谱技术的蛋白定性具有兼容性 [ 1，2] 。由于以上多方面原因，蛋白染色步骤显得尤为重要。 1.1 可供凝胶染色的染料 通常来说，考马斯亮蓝（CCB ) 是应用最广泛的蛋白质染料。然而，它在蛋白检测方面灵敏度较低（蛋白质的检测量为数十纳克) [ 3，4] 。它和蛋白质是通过范德华力和亲水相互作用来结合的。这种非共价结合方式使得染料能与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI- TOFMS ) 兼容 [ 5 ] 。长期以来，CCB —直被认为是大规模蛋白质分析中一种方便的染料。 另一种常用的蛋白质染料是硝酸银（SN ) ，它具有较髙的检测灵敏度（蛋白质的检测量最低可至 1 ng ) ，但会干扰质谱技术进行的蛋白质分析。有两种银染方法被用来观察凝胶中的蛋白——酸性硝酸银和碱性铵银，两者在蛋白的结合特异性、灵敏度、成本和毒性方面有所不同 [ 6，7] 。银可以通过形成银盐的方式结合在蛋白质的谷氨酸和天冬氨酸残基的酸性基团上，或者形成复合体结合在组氨酸、半胱氨酸、

1. 前言 正如所有的亚细胞的蛋白质组学研究，提取细胞壁蛋白质组的关键因素是提取的蛋白质片段不能被来自细胞其他部位的蛋白质污染。通常情况下用两种方法来分离细胞壁的蛋白质。非破裂和破裂蛋白质提取两种方法各自有其优缺点，特别是有关蛋白质污染和改进当前的提取方法。第二个重要方面是多糖多酸类污染物的清除，它们在双向电泳中产生不良作用。过去，细胞培养为细胞壁蛋白质的提取提供了均一并且相对「 干净」的组织来源。虽然分化的组织在生物学研究上相关性更强，但是研究起来更加复杂和困难 ，目前对于这些组织的大规模的蛋白质组的成果相对比较新。本章简单总结现有细胞壁蛋白质提取方法并且描述一种从紫花苜蓿茎中提取细胞壁蛋白质的具体方法。 提取细胞壁蛋白质最古老和温和的方法可能包括在适当的溶液悬浮或者洗涤直接从完整的培养细胞提取。史密斯等 [1] 把番茄的悬浮细胞用 CaCl2 浓度梯度洗涤出伸展蛋白的前体流入小柱子。Scott 和 O'Neil [2] 从胡萝卜悬浮细胞中通过用不同浓度的含有 CaCl2、Triton X-100 和 0.1 mol/L LiCl 的溶液提取胞外蛋白。在 0.1% Triton

1. 前言 用蛋白质组学鉴别植物蛋白质经常遇到植物基因组序列数据量不够的问题。只有拟南芥和水稻被全部测序，这就意味着只有极少情况下可以专门使用质谱分析法（MS) 鉴别蛋白质，通常是用拟南芥这种模式植物 [ 1，2] 。在其他情况下，MS 测序可以同时用 Edman 测序 [ 3,4] 来测定氨基酸末端序列。另一种方法是在用光谱分析法测得末端序列后鉴别蛋白质，然后和已知序列的基因比对 [ 1，3，5，6] 。总的来说，用已知基因组序列的模式植物研究极大推进了植物蛋白质组学。 我们这里描述的这种方法适用于未知基因序列的植物。集中研究少数蛋白质，这些蛋白质存在于已知功能的不同馏分中。因此，我们研究亚细胞结构的蛋白质组学，即细胞核研究，并且将它分为亚蛋白质组进行研究。 很明显，第一步是获取生物材料以用来研究。因为我们感兴趣于研究核蛋白相关的细胞增殖，所以我们选择根尖分生组织细胞群。材料是匀浆后纯化细胞器（此处为细胞核）。从分生组织细胞中分离细胞核比较容易，因为这类细胞核占据很大体积。 从这些被纯化的细胞核中，通过逐渐增加缓冲液离子强度而逐渐增大蛋白溶解度，依次得到的蛋白质组分，最后得到

1. 前目 在多年生植物中，维管形成层产生次生木质部组织而形成了一种独特组织，称为木材 [1] 。木材由疏导分子和非疏导分子组成，用于水和营养物质在树木中的长距离运输 ( 参见 Ecotree 站点可获得更多信息 http://www. botany, uwc. ac. za/ecotree/) 。在裸子植物中，木材主要由两部分组成：管胞和木射线薄壁细胞。在被子植物中，木材同样包含维管束和纤维。这也是一种高度可变的材料。维管形成层的活动和新分裂细胞的分化通常受到环境和个体发育的影响，并最终影响木材特性。 木材在生物圈中贮存大气中过多的 CO2，在我们日常生活中是众多产品的原材料，也是一种用之不尽的可再生资源。可是关于木材形成过程知之甚少。木材形成是一种复杂的现象，由很多基因协同控制，特别是关于多糖、木质素和细胞壁蛋白生物合成和装配的一些基因[2] 。到目前为止，对于木材形成方面的分子机制研究主要通过转录组方法进行，结合 EST 测序以及转录组数据 [3~6] 。关于这方面的大规模转录组研究只有一项：从分化的海岸松的次生木质部组织中鉴定蛋白质 [7] 。 本章描述从 3 种森林