最近我们实验室想做这个试验，以前也没有做过，如果有战友做过这个试验，希望介绍点经验和教训，谢谢。应战友要求，在网上找了一下基础资料，方便大家查看，虽然下面也列出了试验方法，但在实际实验室可能并不一样，希望战友们较少些自己的亲身体会，让大家和我本人在即将进行的试验中少走弯路。先谢谢各位了。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合

效应功能的条件性实施及应答的反馈调节 免疫系统能针对免疫应答的不足和过强实施反馈调节。这不同于通过人为手段改变生理或病理性应答而采用的免疫干预。自我调节是免疫系统不同于其他系统的又一个重要特征。调节的前提是免疫系统对自身应答的强度及其效应具有自我感知能力。 是一个有意义的动物血清交换实验。该处家兔经抗原免疫后，血清中出现高滴度的特异性抗体。如果用一只未经免疫家兔的血清与之交换，即人为降低原家兔的抗体浓度，会出现一个抗体产量突然升高的现象，然后重新缓慢下降。这一升高，不是因为加注了抗原，而仅仅因为，该家兔有效地感知了血清中免疫应答产物(抗体)的含量突然减低后，迅速启动反馈调节，使抗体重新大量产生。这里，机体进行的是一种主动性反馈，生动地展示了免疫系统的一个重要。 抗体浓度对抗体产生的调节 家兔经抗原免疫后产生特异性抗体，用交换输血人为降低血清抗体浓度后，可引起抗体产生量的反馈性升高，并在到达一定强度后逐渐下降。说明机体可感知自身抗体浓度的变化，并自行启动调节机制。 应该说，免疫系统对自身应答的感知和实施反馈调节是一个远未阐明的问题。大概可以用SARS感染作一个例子：

问： 细胞计数过程，用或者不用台盼蓝染色计数有啥区别？？ 不用台盼蓝染色的情况下，计数细胞还是数那些亮细胞？视野下，活细胞怎样判定？ 同一个标本，再用台盼蓝染色计数即等倍稀释后，看到的亮细胞明显减少，两种计数方法结果不一致是为什么？ 问： 1、用或者不用台盼蓝染色计数有啥区别？？ 准确些。台盼蓝可以穿透死细胞的细胞膜，将细胞核染色。活细胞不着色。 2、不用台盼蓝染色的情况下，计数细胞还是数那些亮细胞？视野下，活细胞怎样判定？ 不用台盼蓝基本上不敢肯定细胞的死活，比如有些细胞形态稍大，可能是在分裂过程期间被消化下来用于计数，也可能是死细胞在崩解过程中... 3、同一个标本，再用台盼蓝染色计数即等倍稀释后，看到的亮细胞明显减少，两种计数方法结果不一致是为什么？ 主要的原因可能是因为死细胞中进入了台盼蓝，亮细胞相对就少了，所以也就说明了不用台盼蓝是不准确的，

问：我是做脂肪酶克隆表达的。现在已经将目的基因整合到毕赤酵母GS115中，可是几番诱导下来，就是没有酶活。现在小弟想请教各位战友几个脂肪酶活性检测的问题，怕是表达出来，因为检测方法有误。1、诱导培养基BMMY的磷酸缓冲液浓度为100mmol/L，请问这个浓度是不是太高？如果脂肪酶表达量很低的话，测定过程中产生的游离脂肪酸也很少。如果活性测定的磷酸缓冲液浓度太高的话，会不会影响测定结果，也就是说将酶活掩盖？2、在测完酶活后，发现三角烧瓶壁上粘附着一些乳化油。需要用很浓的氢氧化钠才能清洗掉。请问这是不是说明我的乳化工作做的不好。可是我的乳化液配好了放在冰箱4度保存刚一个周啊？3、菌液在离心时，我是用5000（4度）离心10分钟的。如果有表达的话，这个转速不应该把蛋白离下去吧？我的脂肪酸测定流程：一：微波溶解4％的聚乙烯醇二：聚乙烯醇跟橄榄油混合三：上述乳化液4ml与25mmol的磷酸缓冲液（5ml）混合，50度保温5min四：加入1ml上清，反应20min五：加入15ml95％乙醇终止六：立刻滴定（50mmol的氢氧化钠）请各位战友看看这个流程有没有问题，谢谢！答：乳化液要现配的，PVA与

摘　要　对植物中DNA抽提是在分子水平上对植物进行系统分析与研究的基础性工作.经多次实验，使用改良的CTAB法抽提山茶属植物中总DNA，即在抽提前加入抗氧化剂β-巯基乙醇，并使用冷冻的异丙醇来沉淀DNA， 获得了较好的效果，其纯度和得率完全能满足常规分子生物学操作的要求.关键词　山茶属植物；DNA抽提；叶片；改良CTAB法中图法分类号　Q523；Q949.758.4DNA Extraction From the Leaves of Camellia PlantsTan Xiaofeng Qi LonglinHuang XiaoguangGui Jun(National Forestry Bureau Key Laboratory of Non-timber Product Frostry Breeding and Cultivation,Central South Forestry University, Zhuzhou, Hunan,412006)ABSTRACT　DNA extraction of plant is a basic work to systematically an

一、条带宽不超过1mm，边缘整齐；二、条带在期望的碱基大小之内；三、背景上无smears,也无引物二聚体的出现则是PCR扩增失败，而非阴性反应；四、如果出现期望的碱基大小之外的其它条带，不管是否有期望大小的条带，均应作为人工假像看待；五、在临床标本检测时，尤其对于肿瘤标本，除预期条带外，经常有以外条带或smear现象，但只要其亮度明显低于目的条带，也应视为阳性；六、对于某些情况，尤其在自己设计引物时，如果经费允许，还是应该抽样测序验证。因为用一对引物扩出同一家族不同成员的情况也是有的，如果恰巧这些成员长度相等，则用上述原则无法判别。比如当我在扩MAGEs基因时，曾经一对引物扩出其家族的6个成员，产物均是1000bp左右。实际是MAGE1-6,要是你的原则，那都是MAGE3了。还有我曾用一对引物扩出小鼠，大鼠，兔，人，豚鼠的IgG 1Fc产物均为750bp；七、阴性反应我理解为:由于模板的不存在而使PCR扩增失败。所以是否阴性反应还应和阴性对照相比较。阴性反应没有二聚体和Smaer现象情况并不少见；当然最常见的情况还是二聚体和Smear现象(我们这称为“大马路”)；八、条带整齐就可以了，

柱层析和TLC 操作关键 柱层析 和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀(没有填严实)，使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。 柱层析 关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 装柱子(添硅胶)时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶(固定相)的上表面一定要平

一、目的 了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。 SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物。其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。 三、 试剂和器材 （一） 试剂

1、【仪器名称】：小动物光学分子成像系统。2、【仪器型号】：eXplore Optix 。3、【生产厂家】：GE Healthcare 通用电气（中国）医疗集团（安玛西亚中国有限公司）销售。4、【检测适用范围】：对疾病机理进行深入研究，监测疾病进展，评估治疗效果。5、【仪器使用优点、缺点】：eXplore Optix提供：　　•近红外荧光成像（NIR）——近红外光具有低组织吸收特性，能深层穿透组织。　　•荧光团定量——对荧光强度、相对浓度、深度和荧光寿命进行定量测定，提高数据和分析以及三维重建的质量。　　•集成的多模式平台——可同时对多个生物学靶目标进行生物分布的监测，与活体microCT 进行影像整合，获取精确的解剖学信息。并能将数据以DICOM影像格式无缝输出至临床图像工作站，提高分析能力。应用广泛的近红外荧光成像细胞表面抗原成像　　一些细胞表面受体分子可能在有活化的内皮细胞和肿瘤细胞上过度表达，其相应的高特异性的配体或多肽可经由荧光进行标记，用于肿瘤成像。其它应用　　•细胞内和细胞外环境：使用特定的荧光团寿命衰变的特性，对荧光团所处环境进行辨别。　　•报告基因：监测与信号转导、基

定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。（4）内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竟争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：（1）R Green I 检

免疫荧光技术是将荧光素如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)与相应抗体（或抗原）以化学的方法结合，将荧光标记抗体（或抗原）与标本中相应的抗原结合形成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜观察。在镜下见到有荧光存在即推断有抗原抗体复合物的存在，根据已知的抗体（或抗原）即可推知另一个未知抗原（或抗体）的存在。 1. 直接免疫荧光法　直接免疫荧光法是利用荧光色素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以鉴定未知抗原。本法具有操作简单、时程短、特异性高的优点，但也存在缺点如不能检查抗体，敏感性较差。 （1）在标本上滴加荧光素标记抗体，放入湿盒中。37℃温育30min。 （2）PBS冲洗后，再用PBS分三缸浸泡，每缸3min。 （3）PBS浸泡1～2min，风干。 （4）缓冲甘油封片。在 荧光显微镜 下观察。 进行直接免疫荧光法时应注意：①温育时一定要将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。②用PBS浸泡时应不断振荡。 2. 间接免疫荧光法　间接免疫荧

一．开机前准备1．根据需要选择合适色谱柱。2．在容器中放入已过滤脱气好的流动相，把吸滤过滤头放入容器中。二．开机1．打开所需仪器的电源开关，打开氦气阀门。2．等各仪器自检通过后，开微机进入Windows NT，双击millog.exe，进入millennium 32工作站。三．编辑仪器方法1．选择所需Project，run sample上击右键，选择所需仪器，联机。2．点击instrument method 的edit，设置好各仪器参数。3．保存所编缉的方法。四．样品分析与采集1．点击set up，建立方法。2．等待色谱柱、系统平衡，基线稳定后，设置好样品信息，点击Start，即开始样分析与数据采集。五．报告输出1． 在millennium 32界面点击Brown Project。2． 选择所需Project，选择所要处理的数据文件。3． 选择所要选用的报告格式，输出报告。六．关机1．冲洗色谱柱，排出流路中可能有的缓冲液，并用双蒸水冲洗泵的柱塞杆。2．泵停止，关闭氦气阀门。3．退出工作站，关闭仪器电源。4. 在记录本上记录使用情况。注意事项：1. 所有的溶剂均选用HPLC级试剂。2.

佚名 　　在日常工作中，我们经常要比较某两组计量资料的均数间有无显著差别，如研究不同疗法的降压效果或两种不同制剂对杀灭鼠体内钩虫的效果（条数）等。这时假若事先难以找到年龄、性别等条件完全一样的人（或动物）作配对比较，那么不能求每对的差数只能先算出各组的均数，然后进行比较。两组例数可以相等也可稍有出入。检验的方法同样是先假定两组相应的总体均数相等，看两组均数实际相差与此假设是否靠近，近则把相差看成抽样误差表现，远到一定界限则认为由抽样误差造成这样大的相差的可能性实在太小，拒绝假设而接受H 1 ,作出两总体不相等的结论。 例7.4　为观察中成药青黛明矾片对急性黄疸肝炎的退黄效果，以单用输液保肝的病人作为对照进行了观察，两组患者均为成人，黄疸指数在30-50之间，各人退黄天数如下，试比较用药组（1组）与对照组（2组）退黄天数有无显著差别。 表7.3　急性黄疸性肝炎病人的退黄天数

ICP光谱仪是由ICP光源、进样装置、分光装置、检测器和数据处理系统组成。其中ICP光源由高频发生器、石英炬管和高频感应线圈组成；进样装置是由蠕动泵（一些仪器直接利用同心雾化器提升）、雾化器和雾室等组成；分光装置由入射狭缝、分光元件、若干光学镜片组成及出射狭缝（全谱直读型没有）；检测器现在用的主要是光电倍增管和固体成像器件（目前主要有CCD和CID）；数据处理系统主要有计算机、数据通讯版和仪器控制及数据处理软件组成。高频发生器：高频发生器是ICP-OES的基础核心部件，是为等离子体提供能量的，要求其具有高度的稳定性和不受外界电磁场干扰。从功率输出方式上可以分为自激和它激式两类，自激式高频发生器（瓦里安、PE、GBC、JY、LEEMAN、斯派克、岛津及国内厂家生产的ICP-OES均使用这个）能将稳定的直流电流变成具有一定周期的交流电流后，不需要外加交变信号控制就可以产生交变输出。该RF线路简单，造价低廉，调试容易，当震荡电路参数变化时能自动补偿阻抗的少量变化等优点.缺点是功率输出效率低，震荡频率稳定度不高。它激式发生器（目前仪器我掌握的资料只有热电公司的）是由石英晶体控制频率，必须外加

一、荧光素与抗体结合1、透析法（1）概述：适用于蛋白质含量低、样品体积小的抗体溶液的标记。标记较均匀，非特异荧光较低。（2）步骤：将含10mg/ml的Ig溶液10ml装入透析袋，将上述透析袋放入烧杯中，含0.1mg/ml FITC的pH9.4的碳酸盐缓冲液100ml；4℃磁力搅拌24h，取出透析袋，进行纯化、鉴定。2、搅拌法（1）概述：适用于蛋白质含量较高、样品体积较大的抗体溶液的标记。标记时间短、效率较高，荧光素用量节省，影响因素多，非特异荧光较强。（2）步骤：将含40mg/mlBP溶液5ml装入反应瓶中，加入pH9.0 0.5mol/L碳酸盐缓冲液4ml；25℃磁力搅拌下，逐滴加入1ml含2mg的FITC溶液，25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌4h，然后进行纯化、鉴定。二、荧光抗体的纯化1、除去未结合荧光素：（1）透析法：将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。（2）凝胶过滤法：葡聚糖凝胶G25或G50，用pH7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后

流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器（光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下：1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。一、样品的制备流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号，因此，细胞必须做成单个细胞悬浮状态，不能聚集，也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异（如特异单抗），而且不允许渗透至载液中。标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血

研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达――即：有目的性地合成外源基因产物。在重组DNA技术的发展早期，人们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列（fusion tag）的3’末端，比如大肠杆菌的一段序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融

在动物房舍设施内使用于动物饲养的器具和材料，主要包括笼具、笼架、饮水装置和垫料等，并还有层流架、隔离罩和运输笼等。这些器具和物品与动物直接接触，产生的影响最直接，务必予以重视。其中，层流架和隔离罩等设备可在房舍设施中独立使用，隔离罩更是现今用于无菌动物饲育和实验的主要设备。一、笼具和笼架在笼外的环境符合质量控制标准的情况下，包围动物小环境的质量很大程度取决于笼具、笼架的情况。笼具要求能对动物提供足够的活动空间，通风和采光良好；坚固耐用，里面的动物不会逃逸，外面的动物不会闯进；操作方便，适合于消毒、清洗和储运；成本低廉，经济实用。现在国内已有多家厂商，生产各种式样和质量档次的笼具。笼架是承托笼具的支架，使笼具的放置合理，有些还设有动物粪便自动冲洗和自动饮水器。要注意笼具和笼架的匹配，方便移动和清洗消毒。二、饮水设备和灭菌设备动物饲养用的饮水设备，一般采用饮水瓶、饮水盆和自动物饮水器。小动物多使用不易破碎的饮水瓶；大动物，如羊、犬等多使用饮水盆。这些器具的制造材料要求耐高温高压和消毒药液的浸泡。自动饮水器，有方便操作，节省劳力的优点；但易漏水，供水管道不易清洗、消毒，国内使用不普遍。大型的

1、SCI论文的写作语言表达总体原则 1）正确（correctness）：选择正确词或词组。 2）清楚（clarity）：科学论文的写作完全不同于文艺作品，要求精确、清楚毫不含糊。 3）简洁（concision）：文字要简要，删繁从简。 4）完整性和逻辑性（completion and logic）。写论文就像讲故事，不仅要注意句子完整，论述的“故事”也要完整。特别要注意逻辑性表达“故事”。 5）一致性（consistency）。 2、提高论文写作能力的途径 1）多读。学习任何语言都需要大量阅读。学习英语也需要大量阅读。如果撰写高水平论文，其关键是读很多文献。这个道理虽然简单，但不少学者未必完全明白。时下，很多人都热衷于做题目，以为这是学习英语的正确途径。结果做的练习册一本又一本，试题集一套又一套，做得头昏眼花，兴趣全无，英语水平并没有实质性提高。在阅读时，要用英语思考，不必把英文翻译成中文，否则将大大降低阅读速度，从而影响对阅读材料的全面理解。建议认真地研读影响因子高的国外文献，最好影响因子大于5以上。许多科技人员不善于表达自己的科研成果，主要是对本领域的知识掌握比较少。要特别重

这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。所谓杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid），杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。（一）DNA的变性DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，称为DNA变性。加热、改变DNA溶液中的pH，或有机溶剂等理化因素的影响，均可