zhaolifei认为：分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的**结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨

纳米材料与新型药物制剂 纳米(nm)是英文namometer的译音，是一个物理学上的度量单位，1nm是1m的十亿分之一，相当于45个原子排列起来的长度。当物质达到纳米尺度以后，即在1～100nm这个范围空间，物质的性能就会发生突变，出现特殊性能。这种既具不同于原来组成的原子、分子，也不同于宏观物质的特殊性能构成的材料，即为纳米材料。如果仅仅是尺度达到纳米，而没有特殊性能的材料，也不能叫纳米材料。过去，人们只注意原子、分子或者宇宙空间，常常忽略这个中间领域，而这个领域实际上大量存在于自然界，只是以前没有认识到这个尺度范围的性能。第一个真正认识到它的性能并引用纳米概念的是日本科学家，他们在20世纪70年代用蒸发法制备超微离子，并通过研究它的性能发现：一个导电、导热的铜、银导体做成纳米尺度以后，它就失去原来的性质，表现出既不导电，也不导热。磁性材料也是如此，像铁钴合金，把它做成20～30 nm大小，磁畴就变成单磁畴，它的磁性要比原来高l 000倍。20世纪80年代中期，人们就正式把这类材料命名为纳米材料。 将纳米科技运用于医药领域，将对恶性肿瘤、糖尿病和老年性痴呆等疾病的治疗带

生化分析常需要对组成生物机体的几类主要化学物质如糖、脂肪、蛋白质、核酸、维生素、酶等进行定量测定。在进行定量分析测定的过程中，由于受分析方法、测量 仪器 、所用试剂和分析工作者等方面的限制，很难使测量值与客观存在的真实值完全一致，即分析过程中误差是客观存在的。作为分析工作者不仅要测定试样中待测组成的含量，还应对测定结果作出评价，判断它的准确度和可靠性程度，找出产生误差的原因，并采取有效措施减少误差，使所得的结果尽可能准确地反映试样中待测组分的真实含量。 1．准确度和误差 准确度表示实验分析测定值与真实值相接近的程度。因测定值与真实值之间的差值为误差，所以误差愈小，测定值愈准确，即准确度愈高，误差可用绝对误差和相对误差来表示。 绝对误差为测定值与真实值之差： 式中：△N为绝对误差，N为测定值，N＇为真实值。 例如，用分析天平称得两种蛋白质物质的重量各为2.1750g和0.2175g，假定两者的真实值各为2.1751g和0.2176g，则称量的绝对误差应为分别为

对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。 　　1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上： 　　(1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。 　　(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。 　　(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。 　　(4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。 　　(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。 　　(6) 裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA结合于硝酸纤维素滤膜。

实验材料： 1. 胸腺上皮细胞来源；一般取材小鼠或手术切取的儿童之胸腺； 2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2； 3. 有血清培养液：可使用RPMI1640培养液，添加10%胎牛血清、谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸钠1mmol/L、非必需氨基酸1mmol/L、2-巯基乙醇（2-ME）5×10-5 mol/L、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml（Schreiber et al.1991）。也可以DMEM作为基础培养基； 4. 化学限定性培养液：基础培养液为DMEM，添加HDL100μg/ml、转铁蛋白50μg/ml、胰岛素5μg/ml、氢化可的松2.7×10-7 mol/L、EGF 10ng/ml、硒25 ng/ml以及三碘甲腺原氨酸（T3 ）1×10-10mol/L（Schreiber et al.1991）； 5. 消化液：原代培养时，从胸腺组织制备细胞悬液时，所用的消化液为1mg/ml的胶原酶，用含有15%胎牛血清的DMEM配制。传代时所用的消化液

一、基本原理 吞噬细胞具有对异物(细菌、绵羊红细胞、鸡红细胞等)吞噬和消化的功能，在机体非特异性免疫中发挥重要作用。 小鼠腹腔内注射硫代乙醇酸钠，可刺激巨噬细胞的聚集。四日后小鼠腹腔内注入羊红细胞悬液，一小时后解剖收集腹腔吞嗜细胞，染色、镜检可观察对羊红细胞的吞嗜现象。通过计算吞嗜百分比或吞噬指数可测定吞噬细胞的吞嗜功能。 二、材料 1. ICR小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供） 2. PBS缓冲液 3. 3％硫代乙醇酸钠 4. 1％羊红细胞悬液（北京大学医学部实验动物中心提供） 5. 解剖器材、注射器、尖吸管、橡皮吸头、小试管及载玻片、 6. 瑞氏染液、甲醇 三、实验方法 1. 实验准备：用无菌注射器吸取3％硫代乙醇酸钠3ml，注射于小鼠腹腔内。 2. 四日后，注射1％羊红细胞悬液1ml于小鼠腹腔内。 3. 注射1小时后，将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖暴露腹腔，于腹腔靠上部位，用镊子轻轻夹起腹膜，将腹膜剪一小口，用尖吸管注入5ml预温的PBS，同时用手反复揉搓腹腔约1—2分钟，以便尽可能多地冲洗出小鼠腹腔的吞噬细胞。 4. 用尖吸管吸取腹腔液，置一洁

犬乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 酶联免疫分析（ELISA ） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定犬血清，血浆及相关液体样本中 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 水平 。 实验原理： 本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ ELISA ）测定标本中犬 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 。用纯化的犬 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 抗体 包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 相结合 ，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后 再与 HRP 标记的 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 抗体 结合，形成抗原 - 抗体 - 酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），与 CUTOFF 值相比较，从而判定标本中犬 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 的存在与否。 试剂盒组成 ： 试剂盒组成

生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法（LAB／BA）与桥联亲合素—生物素技术（BRAB）。1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）。近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、SPA等。生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。生物素又称维生素H，多从含量较高的卵黄（α型）及肝组织（β型）中提取，亦可人工合成。生物素分子量为244.31，分子式为C10H16O3N2S，pI为3.5，是羧基转化酶作用的一种辅酶，故又称辅酶R，具有α、β两型，其生物活性基本相同。生物素环形结构中的I环为咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)，

蛋白质组学多维蛋白质鉴定技术 面对1D―SDS和2D―PAGE技术在回收胶中质量极端(很大或很小)、疏水性很强或pH值很高的蛋白质时遭遇到的某些困难，Yates和其合作者(Wolters，Washburn和Yates，2001)发展了一种非基于凝胶的方法，即采用一种所谓的鸟枪法技术来鉴定尽可能多的蛋白质。多维蛋白质鉴定技术(multi-demensional protein identification technology，MuDPIT)的原理可以描述如下：将全部蛋白质复杂混合物一起用胰蛋白酶消化，并将获得的肽逐步分离，第一维在阳离子交换柱上进行，然后在第二维的反相柱上进行。这两种柱构成系列，并与能够完成MS／MS搜索探测的ESI-MS仪器配套。在这项技术用于酵母蛋白质 组分析的第一个描述中，估计从大约200 000个不同的胰蛋白酶水解肽开始，可以每秒超过500个肽的平均速度提送到质谱仪(Washburn，Wolters和Yates，2001)，但只有一部分肽可以用MS／MS模式分析。这项技术在鉴别蛋白质组大量组分中需要的时间和工作量较少，在进行鉴定工作时，蛋白质组中的很多

SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP达到最佳效果，应注意下列事项。 1. 重复性 影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性。一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象。有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。 2. 靶DNA序列长度的影响 在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故。而有人认为在DNA链较短的（400 bp 以下）情况下，DNA的长度不会影响SSCP的效果。他们仔细选择了实验条件，发现354 bp 的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上。 3. 电泳电压和温度的影响 为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行（一般4℃~15℃之间）。在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升

生物医学科研专业设计中常要考虑如何建立动物模型的问题，因为很多阐明疾病及疗效机制的实验不可能或不应该在病人身上进行。常要依赖于复制动物模型，但一定要进行周密设计，设计时要遵循下列一些原则。一、相似性在动物身上复制人类疾病模型。目的在于从中找出可以推广（外推）应用于病人的有关规律。外推法（Extrapolation）要冒风险，因为动物与人到底不是一种生物。例如在动物身上无效的药物不等于临床无效，反之也然。因此，设计动物疾病模型的一个重要原则是，所复制的模型应尽可能近似于人类疾病的情况。能够找到与人类疾病相同的动物自发性疾病当然最好。例如日本人找到的大白鼠原发性高血压就是研究人类原发性高血压的理想模型，老母猪自发性冠状动脉粥样硬化是研究人类冠心病的理想模型；自发性狗类风湿性关节炎与人类幼年型类风湿性关节炎十分相似，也是一种理想模型，等等。 与人类完全相同的动物自发性疾病模型毕竟不可多得，往往需要人工加以复制。为了尽量做到与人类疾病相似，首先要注意动物的选择。例如，小鸡最适宜做高脂血症的模型，因它它的血浆甘油三酯、胆固醇以及游离脂肪酸水平与人十分相似，低密度和极低密度脂蛋白的脂质构成也与人相

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一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf 值（比移）来表示的： R=原点到层析点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、器材1、层析缸 2、毛细管3、喷雾器4、培养皿 5、层析滤纸（新华一号） 四、试剂 蛋白实验技术论1、扩展 是4 份水饱和的正丁醇和1 份醋酸的混合物。将20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用. 2、氨基酸溶液0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。各5mL

离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。（一）、差速离心（differential centrifugation） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀（二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层

相关专题 大三的时候，跟着老师做课题，刚进入实验室，师兄就丢了一大堆空的枪头盒，让装枪头，愣是包办了整个实验室给半年的枪头。在这里总结了大家枪头灭菌的方法，其实很简单。 枪头如何灭菌? 将放入枪头盒中湿热灭菌。121度，15-20分。为了避免水蒸气困扰，可以在枪头盒外包上报纸，或者灭菌后置于温箱中干燥。 高压蒸汽灭菌时为什么枪头盒要用报纸包着灭菌? 报纸包可以二是避免有太多水，可以吸水，最主要的是防止再次污染!不过不包的话和没有太大影响，灭菌完成后水多的话可以在烘箱里放时间长些! 提取RNA时移液器 要不要灭菌? 枪一般不需要灭菌!如果实在需要的话，就放在超净工作台用紫外光照射半小时! RNA提取 时枪头灭菌? 用普通的EP管和枪头，在高压灭菌前，还要用DEPC水浸泡过夜来去除RNase，隔天去除DEPC后将放入枪头盒中湿热灭菌。121度，15-20分。为了避免水蒸气困扰，可以在枪头盒外包上报纸，或者灭菌后置于温箱中干燥。最好是每次提取前直接灭菌，最好不要利用放置很久的枪头提取RNA.国产

参照限制性核酸内切酶酶切位点在HLA等位基因DNA序列上的分布情况，根据样本的PCR-RFLP结果，对样本的HLA基因型别进行判断。由于篇幅限制，仅介绍DR1纯合子亚型的鉴定作为说明。 DR1纯合子样本各种等位基因的PCR-RFLP带型： DR1等位基因组合 限制性核酸内切酶 Ava II Pst I 0101/0101 1 1 0102/0102 1 0 0103/0103 0 1 0101/0102

甲基化特异性 PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为 尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互 补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。MSP 实验流程： 抽提基因组DNA，并定量 （组织、细胞、全血、血浆/清等）亚硫酸氢钠处理DNA（pH5.0 50℃ 8-16hr所有试剂新鲜配制）DNA修饰后纯化回收PCR/Real-time PCR检测（引物、退火温度）琼脂糖凝胶电泳/拷贝数 难点：1、 实验流程长，操作烦琐，不易控制；2、 起始DNA量不能太多，否则修饰不完全；但量太少，在漫长的修饰、回收过程中容易丢失，所以要求熟练而精细的实验操作。3、 修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置，并且需要反复摸索找出合适的反映时间。4、 PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都需要不断优化。

问：不好意思，请教一个简单的问题，试剂瓶上标DL××氨基酸，是否含有D-××氨基酸和L-××氨基酸各半？答：DL氨基酸 应该是外消旋氨基酸，也就是L型与D型氨基酸各一半，旋光度为零的氨基酸。这种氨基酸生产工艺比单一旋光氨基酸简便，价格也便宜。这种氨基酸一般都是化学法生产的，Ｄ型跟Ｌ型的氨基酸可能大体上等量，也许旋光度并不正好为零。楼主做实验如果做其它不涉及旋光度的试验可以放心使用，如果是涉及到旋光度变化，应慎用，最好选用单一旋光氨基酸。加倍总量上是可以达到实验要求，如果你的反应是L型氨基酸转化成其它的物质，D型氨基酸不会影响反应进行，加倍应该问题不大。但是如果你的实验中D型氨基酸会影响反应，例如该反应是由L型转变成D型的，这时由于存在很多的D型氨基酸，在进行反应时，会牵扯到反应平衡的改变，影响反应速率。这时就应该慎用，最好选用光学纯单一旋光氨基酸。

人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）是Kjeldsen等人于1993年在中性粒细胞的特殊颗粒中首先发现的。以往的研究表明NGAL与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程密切相关。NGAL在乳腺癌、食管癌、结直肠癌、胃癌、慢性粒细胞性白血病等细胞系中均过表达，并在癌细胞的浸润与不良分化中发挥重要的作用。进一步研究证实，NGAL是存在于中性粒细胞和某些上皮细胞中的一个小蛋白，也存在于肾小管中，肾损伤发生后NGAL表达显著增加，并在尿液和血液中释放。 急性肾损伤（AKI）是临床常见病、多发病。并且，随着高血压、糖尿病等疾病的发病率上升，肾病患者也以每年10%的速度在增长。在所有的住院患者中，急性肾损伤的发生率达到7%。ICU(重症监护)的患者中大约有50%会发生急性肾损伤。早期肾病往往没有症状和体征，很多患者就诊时已达到终末期肾病，错过了最佳治疗机会。 传统的肾病诊断多以肌酐、肌酐清除率、蛋白尿、血尿素等作为主要指标，然而这些项目不能发现早期肾损伤。而

荧光定量PCR仪在国内市场推广从98年开始已经经历了6年，从开拓者PE（ABI）到ROCHE,再到后来鱼龙混杂，各种荧光定量PCR仪纷纷登陆我国市场，使得中国市场成为世界上最为繁荣的荧光定量PCR技术应用市场，笔者由于从一开始就从事该项技术再中国的推广，就亲身经历的几种仪器来谈谈他们的优缺点，抛砖引玉使大家在应用这项技术的过程中提供一定的帮助。荧光定量PCR仪的鼻祖是PE7700（ABI公司推出）。而后从其进入我国市场的时间顺序上分别产生了PE5700、ROCHE的lightcycler、biorad的icycler、澳洲的ROTOR GENE3000等，还有就是在01、02年之后任何一台荧光PCR仪都在中国赚得盆满钵满之后许多荧光pcr仪纷纷进入中国，枫岭、MJ等等许许多多，不一而足。每种仪器在市场推广过程中都会“制造”许多与其他产品不同得优势以获得相对得比较优势，但从笔者多年得使用经历和比较中得出一个结论，那就是无论厂商如何宣传，判断一台荧光PCR仪的好坏的依据不是PCR反应时间（它不是百米赛跑），不是PCR体系大小（它不是蔬菜）。不是PCR仪器大小（它不是彩电），而是PCR扩增水