pET 是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。经pET系统过与使用过和正在使用这个系统的科学家的交流，我们发现了一些在使用pET系统的过程中以及原核表达中的一些常见问题。在此，我们选取了其中一些比较有代表性的问题，附上我们的建议改进方案，并期待和你一起分享成功的喜悦。 1.目的蛋白总是以不可溶的形式出现真是令人烦恼 在大肠杆菌中表达的异源蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实践中，有很多实验室采取降低诱导温度，例如25–30°C(Burtonetal.(1991)Prot.Exp.Purif.2,432-441)，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基(BlackwellandHorgan(1991)FEBSLett.295,10-12)等方法获得更多的可溶蛋白。随着越来越多的蛋白折叠途径被阐明，相信会出现更多有效的增加可溶性目的蛋白的

相关专题 纯水和超纯水是分子 和细胞实验中常用的实验试剂，不同的实验需要的水的级别是不一样的，常常遇见刚进实验室的同学常有个疑问：纯水和超纯水是一样的么？下文主要讲述了纯水和超纯水区别以及纯水仪和超纯水仪的工作原理。 纯水和超纯水区别 在正确选择实验室超纯水机之前，我们必须很好地了解如下几个概念：什么是纯水?什么是超纯水?二者有何区别? 纯水又称纯净水，是指以符合生活饮用水卫生标准的水为原水，通过电渗析器法、离子交换器法、反渗透法、蒸馏法及其他适当的加工方法，制得的密封于容器内，且不含任何添加物，无色透明，可直接饮用的水。市场上出售的太空水，蒸馏水均属纯净水。 超纯水是在纯水的基础上进一步将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水。电阻率大于18MΩcm，或接近18.25MΩcm极限值。超纯水是一般工艺很难达到的程度，可以将微滤技术、超滤技术、反渗透技术、EDI技术，离子交换技术中的两种及以上的技术，通过合理的工艺设计，设备选型，方可制造出超纯水，电阻率可达18.20MΩ

制作方法与配方 一、【ＥＭ原液发酵方法】 ：制作ＥＭ菌种发酵液——EM原液 　A、菌种活化：用ＥＭ菌种10克、红糖0.1公斤（红糖先用热水溶化），加入1公斤的水。注：（先把水加热到100°C后加入红塘或白糖，而后继续加热5分钟。冷却到40°C时加入ＥＭ菌种），密闭发酵(35°C-37°C温度)下发酵3-5天，第3天可以放气一次！打开容器口闻到有酸甜味即活化成功。可以作为液体菌种使用。 　B、制作原液：将活化好的液体菌种加入二级发酵罐(密闭)(加水比例按1:10的比例加入)。 二级发酵液的配比：红糖10%、维生素0.3%、氨基酸0.1%。 制作原液发酵温度：密闭发酵(35°C-37°C温度)下发酵3-5天。 成品发酵液的标准：气味酸甜、PH值=4.0-6.0、活菌含量≥100亿/ml。 二、【水产养殖水肥配方】 　1、有机肥：（发酵动物粪便 40%，桔杆或草粉 10%，泥碳土 20%、活性小肽

一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0～3.9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5.0；(2)修饰时间应掌握在10～16 h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；(3)反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)；(4)DNA模板量应控制在<2 ug为宜。只要遵循以上几点基本上能保证99%未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA有约96%已经降解 。当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA)，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原(约1 g)作为载体，有利于DNA沉淀(加入载体后轻轻晃动Eppendof管可见絮状DNA富集现象) 。二、甲基

作者单位：212001 江苏省镇江市中心血站作者简介：朱阳泉(1967-)，男，江苏镇江人，主管技师，本科，主要从事输血传播疾病和血型研究。电话：0511-5021106，E-mail：yangquanzhu@yahoo.com。【摘要】 目的探讨3种常见的影响全自动酶免分析系统检测结果的因素，提高EI ISA法检测结果的准确性。方法(1)随机选择对照组和实验组各44份无偿献血者血样，分别进行两种不同方式的抗凝，应用FAME全自动酶免分析系统进行HBsAg、抗一HCV、抗一HIV、TP 4个项目检测，比较两组检测结果。(2)在全自动加样仪的加样高度设置中，不断增加加样高度，观察FAME对4个质控血清平行孑L的检测效果。(3)在不同温度的FAME洗液下，对88份正常的无偿献血者血样进行4个项目检测，观察不同温度的洗液对检测结果的影响。结果 (1)除抗一HCV外，实验组中其他3项检测结果均有假阳性出现，且阴性标本的S／CO值明显高于对照组(P)【关键词】FAME全自动酶免系统 EIISA 影响因素【中图分类号】R446．1 R446．61 【文献标识码】A 【文章编号】l671-2587(

PCR基本原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构 成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结 合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结 合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对 与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因 扩增放大几百万倍。 反应条件一般为： 变性温度和时间 95℃，30s 退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）

【求助】免疫磁珠分选后阳性细胞极少参与者：fjxm81今天第一次用MACS磁珠进行胚胎肝细胞阳性分选，我是先将细胞与兔抗鼠一抗孵育，然后再用相应磁珠（羊抗兔磁珠）进行孵育。结果得到的阳性细胞极少无比，从早上到现在饭都没有吃，结果。。。呜呜，各位高手有没有做过类似的实验，给指点一下啊！谢谢。象这样的实验，你们一般一抗会按什么浓度开始试呢？10的7次方的细胞一般是用多少μg抗体进行孵育？参与者：fjxm81怎么没有人理我啊。高手帮帮忙呢！谢谢！！参与者：wxlcmu胚胎肝细胞没有分过，我们用免疫磁珠分离IFN阳性细胞的时候，10e7及以下的细胞抗体的用量是试剂盒的推荐用量，为20微升。有一个方法可以相对的提高筛选出的阳性细胞的量，你在细胞过柱之前，在柱的底部安一个G25的针头，由于针头比较细，所以液体流下的速度会降低，因而磁珠标记的细胞经过柱的时间会延长，进而提高阳性细胞的获得率，希望这个方法对你有用。参与者：fjxm81非常感谢谢楼上的，下次我用这个方法试试看。最近尝试用流式试一抗的最佳浓度，然后再作磁珠分选。磁珠分选实在是耗钱啊！参与者：医生和球以前曾遇到跟楼主类似的问题，后来增加了孵

英国漂莱特系列离子交换树脂 强酸性阳离子交换树脂系列 1、C100, 强酸苯乙烯系树脂, 高交换容量，软化除盐树脂。 2、C100E, 强酸苯乙烯系树脂, 特别适用于家用或工业软化水的制备。 3、C120E, 强酸苯乙烯系树脂, 专为硬水软化设计，特别适用于小型家用。 4、C100×10, 强酸苯乙烯系树脂, 抗氧化性能优越，在混床中和阴离子有良好分离性能。 5、C150, 大孔强酸苯乙烯系树脂, 优良的耐磨和抗渗透冲击性能，适用于凝结水处理，连续交换及特殊应用。 6、C160, 大孔强酸苯乙烯系树脂, 极高的交联度，高交换容量，专为Quentin工序提供，用于处理工业废水，具有极好的抗氧化性能。 弱酸性阳离子交换树脂系列 1、C104E, 大孔弱酸丙烯酸系树脂, 高交换容量，良好的动力学特性。 2、C105, 弱酸丙烯酸系树脂, 高交换容量，能除去暂时的硬度和碱度，并提供E极产

细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。（一）间期间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。1. G1期此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后，分化并执行各自功能，此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段，细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。2. S期是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。S期一般需几个小时。3. G2期为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定，需用1～1.5小时。（二）分裂期细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。1. 前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心

RNA的完整性可以通过琼脂糖变性电泳分析检测,而含量则通过紫外分光光度计确定。常见的变性电泳有甲醛变性电泳，戊二醛变性电泳等。甲醛变性电泳检测RNA完整性一、材料、试剂和仪器1 材料: 植物总RNA 5-10μg2 试剂:1）加样运载缓冲液（Loading buffer），50% 甘油，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.25%溴酚蓝，25%二甲苯氰FF2）10×TAE Buffer3）5×甲醛凝胶电泳缓冲液：，0.1mol/L MOPs (pH7.0)，40mmol/L乙酸钠，5mmol/L DETA(pH8.0)4）甲醛, 甲酰胺3 仪器: 电泳装置，紫外透射观测仪二、实验程序1 甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose （Sigama），再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。2 RNA的甲醛变性电泳1） 样品制备，RNA总量10μg，5×甲醛凝胶电泳缓

一、实验目的 学习利用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，掌握浓度和纯度的计算方法和实验操作技术。 二、实验原理 组成核酸的碱基(G, A, T, C）在260 nm处具有强吸收峰，所以通过测定260 nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同，因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。 核酸样品中最常有的其它吸光物质为蛋白质，由于蛋白质在280 nm处具有强吸收峰，因此测定A260/A280比率，可以判断DNA的纯度。纯化的DNA及RNA的A260/A280 比值应分别接近1.8 及2.0，当溶液中含有蛋白质时，会造成A260/A280 比值降低。 计算原溶液的浓度（A）： A260×转换因子×稀释因子 = 原溶液DNA浓度 (μg/ml) 每吸光单位 转换因子：双股DNA为50 μg/ml；单股DNA或RNA为40 μg/ml 计算原溶液的摩尔数（以500 bp大小的DNA片段为例）： 每个脱氧核苷酸的平均分子

(1)材料 琼脂斜面培养基 经分离培养的平板培养物。 (2)方法 ①在琼脂斜面培养基试管上部标明移种的菌名(或编号)、接种日期、接种者的组别及代号。 ②左手持长有细菌的平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌冷却后，沾取平板划线上发育良好的孤立菌落。把平板放回原处，立即用此手取斜面培养基斜持，用右手小指与手掌夹持棉塞，轻轻转动后拨出棉塞，管口通过火焰灭菌。 ③将已沾菌的接种环伸入斜面培养基的管底部的凝固水，沿斜面培养基的表面从底向上划一直线，然后再从底部向上划连续曲折线；也可不划直线只划曲折线。取出接种环，管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，放试管架上，接种环火焰灭菌后放下。 向斜面培养基上移种的细菌如果是生长在斜面培养基上的，或是生长在液体培养基中的，则用左手同时斜持菌种管和斜面培养基两个管，右手无名指、小指手掌同时拔起夹持二个棉塞。管口及接种环先经火焰灭菌后，从菌种管取菌立即移种到斜面上，塞好棉塞，接种环火焰灭菌后放下。然后将斜面培养基放37℃恒温箱中培养24h。结果斜面表面形成菌苔。

一、RNA酶保护试验（RPA） RNA酶保护试验（（RNase Protection Assay，RPA）即糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。本文主要介绍了核糖核酸酶保护分析实验的从试剂准备到、操作步骤以及实验结果全部的操作流程，供大家分享。 二、材料准备及操作步骤 试剂准备 1. GACU POOL：取100 mM ATP、CTP、GTP各2.78 μl、100 mM UTP 0.06 μl，加DEPC H2O至100 μl。 2. 杂交缓冲液 IPES 0.134 g、0.5 M EDTA（pH8.0）20 μl、5 M NaCl 0.8 ml、甲酰胺8 ml，加DEPC H2O至10 ml。 3. RNase消化液：5 M NaCl 120 μl、1 M Tris-HCl（pH7.4） 20 μl、0.5 M EDTA（pH 8.0）20 μl、RNase A（10 mg/ml） 8 μl、RNase T1（250 U/μl） 1μl，加DEPC H

佚名 细菌种类多、繁殖快、适应环境能力强，因此，细菌广泛分布于自然界，在水、土壤、空气、食物、人和动物的体表以及与外界相通的腔道中，常有各种细菌和其它微生物存在。在自然界物质循环上起重要作用，不少是对人类有益的，对人致病的只是少数。 一、细菌在自然界的分布 (一)土壤中的细菌 土壤中含有大量的微生物，土壤中的细菌来自天然生活在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体进入土壤的细菌。它们大部分在离地面10～20厘米深的土壤处存在。土层越深，菌数越少，暴露于土层表面的细菌由于日光照射和干燥，不利于其生存，所以细菌数量少。 土壤中的微生物以细菌为主，放线菌次之，另外还有真菌、螺旋体等。土壤中微生物绝大多数对人是有益的，它们参与大自然的物质循环，分解动物的尸体和排泄物；固定大气中的氮，供给植物利用；土壤中可分离出许多能产生抗生素的微生物。进入土壤中的病原微生物容易死亡，但是一些能形成芽胞的细菌如破伤风杆菌、气性坏疽病原菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌等可在土壤中存

RHB0-80糖度仪是用来测量与糖有关的溶液（如水果汁、软饮料、蜂蜜、酒等），确定食物、饮料的糖含量以及水果的最佳成熟期，控制生产过程溶液的浓度，也可用来控制各种工业溶液的浓度（如切割液和磨削液）。具有各种测量范围。产品的选用，请根据具体溶液的浓度和产品的参数选择。 一、使用方法 第一步 掀开（进光棱镜及座）1，用柔软的绸布或棉花仔细地把检测棱镜（折射棱镜）2表面拭净，注意不要划伤镜面。 第二步 取试液数滴，放在检测棱镜（折射棱镜）2的镜面上，徐徐合上进光棱镜及座，使试液遍布于折射棱镜表面。 第三步 将（进光棱镜及座）1对向光源或明亮处，转动视度调节圈（手轮）6使视场的分界线清晰可见。视场明暗分界线所示读数，即为试液含糖量（折射率）。 RHB-80型折光镜可转动旋钮（调焦轮）9来选择0～50%和50～80%两档测量范围。 二、温度修正 取纯净蒸馏水数滴，放在折射棱镜2的镜面上，拧动（调节螺杆）4，使视场中的明暗分界线对正刻线0%，然后进行试样测定，即可校正温度带来的误差。 另一种温度修正的方法是：利用温度修

免疫细胞化学的发展对许多领域的研究起到很大的推动作用，在神经科学的研究中尤为突出。本文仅就免疫细胞化学在神经科学的基础研究方面的应用做一简单介绍。1、确定神经递质的性质、定性和分布早期的神经科学工作者应用传统的神经解剖学研究方法如甲基蓝染色法、镀银染色法等对中枢及外周神经系统的结构做了大量的研究工作，但由于技术方法的限制，对神经递质的性质无法确定。1949年Koelle建立了胆碱酯酶染色法（cholinesterase staining method, ChE）1964Rh，Karnovsky 和Roots在此基础上改良并建立了一步完成的乙酰胆碱酯酶（Acetycholinesterase, AChE）直接染色法，使显示胆碱能神经成为可能。从生物测定来看，AchE和胆碱能神经的标志酶存在平行关系。因此，一般认为，在加用乙酰胆碱酯酶抑制剂的情况下，用AchE 显示胆碱能神经，仍不失为一种简便易行、可信的技术方法。但必须指出的是，一些接受胆碱能神经支配的细胞（称为胆碱能敏感细胞）和一些非神经细胞（如红细胞和骨骼肌）也可呈AchE阳性反应，甚至中枢神经系统内去甲肾上腺素（NA）能神经元集中的

六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。 工作原理： 1、手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出； 2、将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。 虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。 以下浅谈有关六通阀进样器的使用及保养事宜(仅供参考)： 1、手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一

原理 直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。 特点 是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。 缺点 培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。 材枓 dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） 培养基制备 基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时

降血脂药他汀类无论是之前成熟的发酵品种，还是当下发展迅速的全合成产品，一直是处于不断革新和改进的状态，特别是新的酶法工艺的发展，引领着市场的走势。 从整体环境看，我国的环保、安全成本将继续逐步加大，人力成本持续上涨，这些必然的趋势所带来的，是所谓的“中国制造”优势的部分散失。 目前全球包括美国在内，都在流行“制造业回归”，虽然和化学原料这种环境污染压力较大的品种情况会不一样，但印度开始大量输出洛伐他汀的情况，无疑是这样一个大经济环境下的一个缩影。而技术革新和进步，才是目前左右他汀类原料市场的主要推手。 如果描述2012年的他汀类原料市场，以进口洛伐他汀突然大举“入侵”为突出特征，引发过去几年相对平静的市场，再起狼烟。虽然没有烽火连天，但也是硝烟漫漫。而代表新势力的全合成类阿托伐他汀和瑞舒伐他汀则全面出击，呈现强势增长。他汀类药物市场格局现状 降血脂药（降胆固醇药）成为全球第二大治疗药物类别，全年销售额达159亿美元，同期增长21％。他汀类降血脂药是降血脂药的主力军，主要品种有辉瑞的Lipitor（阿托伐他订）、默克的Zocor（辛代地汀）、BMS的Pravachol／Mev

髓内针内固定术 髓内针内固定多用于长管骨（如股、肱、尺、胫、桡骨等）骨干骨折。其优点是：髓内针本身比较坚实牢靠，术后可以少用或不用外固定，有利于伤肢的早期活动锻炼；皮肤切口较小，骨膜剥离范围有限，损伤较小；髓内针长而有不同形状棱角，嵌入髓腔，可以达到牢靠的内固定，能够避免旋转、侧移及成角移位的发生。其缺点是：需有一定设备，操作较为复杂。 用髓内针固定长管骨的骨折，犹如用一根轴穿过两节竹管。如果髓内针的外径等于长度骨的内径，这样固定作用就好，可以稳定地保持对位、对线。在长管骨的最狭窄段（如尺骨、桡骨中段、股骨、肱骨和胫骨的上、中1/3交界处）发生骨折，相应宽度的髓内针可直接紧密地嵌在髓腔周围的皮质骨内层上，使针的横断面能起到良好的弹性固定作用，针的两端又能固定于松质骨中或进针处的皮质骨上，防止各种移位，是较理想的内固定。当骨折发生在长管骨的非狭窄段，虽不能依靠髓内针直接的弹性固定作用，却可依靠上、中、下三点固定作用而达到骨折的稳定。 髓内针的种类有梅花形、v形、菱形、三角形及圆形等。股、肱、尺骨用直髓内针，胫、桡骨须用弯髓内针。梅花形与v形髓内针的优点是