本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上： 在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。 实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做： 第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。 大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。 第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因

在一个下着雪的圣诞节前夜，一个饥寒交迫的小男孩，手里拿着一个破旧的三角瓶，在大街上走着。 他敲开一家大门：“先生，你有板子要倒么？” 结果给踹了出去：“没有！扫兴。” 再一次：“女士，你有不愿做的板子要我帮忙么？一美分2板。” “谁还倒板子啊，都在做液体培养基。” 可怜的小男孩就这样不断的被拒绝。他实在走不动了，疲乏地缩在一个墙角里。他不敢回家，因为他没有倒掉一个板子。家里而且也很冷，风可以从许多地方刮进屋 子里来。他冻得发抖，需要温暖。哪怕一个板子的温暖也好。他的一双手 几乎冻僵了。太冷了。他决定倒一个板子。 “哧！”板子倒出来了，象一瓶温暖、光明的LB，小男孩觉得象坐在火炉旁一样。火烧得那么欢，那么暖，那么美！这是怎么回事呢？火焰突然熄灭了，LB也不 见了。他坐在那儿，手中只有做出的板子。他又倒了一次板子，变成一朵粉红色的光焰。 他发现自己坐在一根美丽的亲和柱下，比中午见到的那根亲和柱还要大，还要美丽。它的管壁里有几千万个beads。小男孩把双手伸过去，板子又熄灭了。几千 万个beads都变成了明亮的星星。这些星星中有一颗落下来，在天空中划

细胞毒检测技术包括补体依赖细胞毒试验、NK细胞介导的细胞毒试验和特异性CTL活性检测，常用的实验技术有后两种。NK细胞（natural killer cell）是在天然免疫系统发挥主要作用的效应细胞，可直接杀伤病毒感染的靶细胞和某些肿瘤细胞。而细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）则是特异免疫系统发挥特异杀伤作用的效应细胞，可特异杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。本节介绍乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞活性、Calcein释放实验检测CTL活性。 　　一、乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞活性 乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I (NADH2），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计

细胞培养名称：新生大鼠皮质星形胶质细胞培养组织来源：种属：大鼠年 龄：新生1天-2天取材部位： 皮质选用的酶：0.125%胰酶消化时间：37度15min注意事项：胰酶平时用1.5ml EP管分装冻存，用时解冻，37预温1min，以保持胰酶好的活性，消化时每隔5min轻轻摇动消化组织。细胞培养名称：成年大鼠室下区星形胶质细胞培养组织来源：种属：大鼠年 龄：成年2.5月零取材部位： 室下区/室周区选用的酶：0.125%胰酶+0.02%EDTA消化时间：37度25min注意事项：每隔5min轻轻摇动消化组织吹打时采用分步吹打，先用较粗的巴斯德吸管吹打4-5次，静置后转移上部悬液，原管加培养液后换细管吹打。细胞培养名称：大鼠前脂肪细胞培养组织来源：种属：大鼠年 龄：2月龄180-220g取材部位： 副睾脂肪垫选用的酶：0.25%胰酶-0.02％EDTA消化时间：时间很快 大概就1分钟细胞就开始变圆消化流程：倒掉旧培养液，PBS洗2遍，加0.5ml消化液均匀润湿，镜下观察，细胞开始变圆马上加完培中止消化，1000rpm离心5分钟，去上清加培养基重悬细胞，1：2或1：3接种。注意事项：细胞消化很快

mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。 差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12 MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型

引物延伸实验 一些常见问题： 1. 什么是引物延伸实验？ 引物延伸实验用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域， 随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA，长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。 2. 作这样一个实验必须用什么试剂？ 引物延伸实验需要模板RNA，可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物，用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物，还需要反转录酶，AMV或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶试

1. 凝胶肿胀或卷曲 注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。 2. 条带歪斜、或漂移 因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。 另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。 3. 单个或多个白点 转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。4. 转膜缓冲液过热 缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜，效果很好。5. 背景过高 （1）封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BS，1%吧。 （2）一抗或者是

血液中 miRNA 的组成血液中的 miRNA 到底是从何而来? 要往哪里 去? 这些 miRNA 的生理功能是什么? 以上这三个 问题是很多研究人员关心的问题，事实上这些问 题目前并没有很明确的答案，我们知道 miRNA 是 内生性的短片段 RNA，长度约 17 到 23 核苷酸， miRNA 可以藉由和信息 RNA（mRNA）结合诱导 信息 RNA 的降解，进而调控信息 RNA 和相对蛋 白的表现。根据一些论文的揭示 1 和实验室实际的 操作经验显示，正常人的血液中 miRNA 的含量是 极微量的，但是在病人和检体制备不佳的血液样 本中却可抽取到较大量的 miRNA，根据这些观察 现象的合理臆测，病人血清中 miRNA 的来源。很有可能是因疾病造成的组织坏死或细胞凋亡破裂 而流泄出来的胞内 miRNA，经由病人和正常人的 基因表现的芯片图谱比较，结果也倾向有或无表 现的差异，而非特定 miRNA 表现量上升；换言之，我们观察到相关的研究中，病人的 miRNA 的表 现数目增加了，而分析ㄧ些在正常人和病人中都 有表现的 miRNA，表现量的高、低反而是其次的 表征。因此数据分析的逻辑

ATP酶，又称为三磷酸腺苷酶，是一类能将三磷酸腺苷（ATP）催化水解为二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根离子的酶，这是一个释放能量的反应。在大多数情况下，能量可以通过传递而被用于驱动另一个需要能量的化学反应。这一过程被所有已知的生命形式广泛利用。部分ATP酶是内在膜蛋白（Integral membrane protein），可以锚定在生物膜上，并可以在膜上移动；这些ATP酶又被称为跨膜ATP酶。 跨膜ATP酶可以为细胞输入许多新陈代谢所需的物质并输出毒物、代谢废物以及其他可能阻碍细胞进程的物质。例如，钠钾ATP酶（又称为钠／钾离子ATP酶）能够调节细胞内钠／钾离子的浓度，从而保持细胞的静息电位；氢钾ATP酶（又称为氢／钾离子ATP酶或胃质子泵）可以使胃内保持酸化环境。 除了作为离子交换器，跨膜ATP酶还有其他类别，包括共转运蛋白（co-transporter）和“泵”（也有部分“离子交换器”也被称为“泵”）。这些跨膜ATP酶中，有一些可以造成膜内外电荷的流动，其他的则不行，因此又可以将这些转运蛋白分为生电型（electrogenic）和非生电型。

全基因组扫描 遗传 分析仍是当前对致病相关基因识别、鉴定的主要方法，分为连锁分析和关联研究两种。由于人类基因组多态性的研究以及SNP分型技术的发展，目前全基因组连锁分析和关联研究亦变得切实可行。根据研究规模的大小，可以将疾病遗传分析分为以下几类，即定位克隆、连锁不平衡基因定位、全基因组候选基因分析、候选基因关联研究和定位候选基因克隆，其中定位克隆、连锁不平衡基因定位和全基因组候选基因分析均属于全基因组扫描。 不管是单基因疾病还是多基因疾病，通常是先行全基因组扫描(genome scanning)；将疾病相关位点定位于染色体某个区域，然后再行候选基因策略或连锁不平衡分析，确定致病基因位点。如果利用家系进行连锁分析，即采用定位克隆；若是利用群体样本，则应用连锁不平衡分析进行基因定位。全基因组扫描已成功地应用在许多疾病的致病相关基因克隆上，并取得了一定的成果。 全基因组扫描所利用的是在人类基因组大量存在的微卫星或SNP，虽然当前使用较多的仍是微卫星，但由于芯片技术的发展，全基因组高分布密度的商品化SNP芯片相继面世(如Affymetrix公司的10k，100k和

相关专题 根据载体 的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS)，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。

经常做RNA实验的朋友可能都会有所感触，RNA比较脆弱，容易降解。有的时候RNA可能会在不知不觉中“消失”了，而RNA的质量又关系到后续实验的成败，所以保证RNA的质量有着至关重要的作用。 最为常用的检测RNA 质量的方法是电泳法，比较容易成本低，但是比较耗时，需要的样本量比较大，同时不能够反应足够的细节。 有的时候，我们可能仅仅能够拿到很少量的RNA，是很难用电泳法来检测的，比如说少量的Poly A+RNA或miRNA样品等等。这个时候怎么办？ 很多时候若是没有办法，也只能是硬着头皮继续往下做，有结果了就很高兴好像也说明RNA没有问题，若是没有结果又很难说明问题是出在那里，真的是令人头疼。不过，话又说回来，有结果就说明原来的RNA没有问题吗？你知道你所使用的RNA的细节吗？ 若是用bioanalyzer来分析和检测RNA的质量就要容易得多，并且很敏感，很少的样本就可以用来检测，并且结果的可重复性非常高，但是需要专用的仪器，试剂等，所以费用较高。 bioanalyzer 到底能干什么？下面的图表会给你一个较为清晰的了解和认识，看来用处还不少呢！bioanaly

多糖和蛋白质的结合疫苗 由多糖抗原 与蛋白质偶联而成。多糖对人体无毒性、容易产生、结构稳定，广泛存在这细菌表面抗原结构中。该种疫苗具有能诱导婴幼儿产生保护性免疫应答的优点。因此在设计上首先选择能够产生较好保护性免疫反应的多糖抗原，载体蛋白应安全、可靠，通过还原胺化、酰胺缩合、硫醚缩合等方法进行多糖和载体蛋白的偶联。 目前，在细菌性结合疫苗中所使用的载体蛋白有：白喉毒素、霍乱毒素、重组蛋白D、膜蛋白质、外膜蛋白质、链球菌C外膜蛋白质以及与多糖抗原同源的细菌外源蛋白等。多糖成分有：脱氧乙酰基C多糖、C多糖、聚核糖磷酸核糖醇、A多糖、Vi多糖等。由于多糖抗原与载体蛋白采取偶联的方式，故在设计中应注意连接模式，现在常用的是末端连接模式和交叉连接模式两种。末端连接是将糖链末端与蛋白质连接，使蛋白质分子与糖链的连接呈放射状；交叉连接是利用蛋白质分子和糖链上的多个可以相互连接的基团，形成网状蛋白糖链结构。 此外，设计中应注意不同疫苗间不要使用相同的载体蛋白，因为载体蛋白在机体中可产生免疫反应。新结合疫苗接种后，可能被机体抗载体蛋白抗体清除，达不到疫苗的效果。

一、CRISPR 系统的发现-从细菌的获得性免疫说起 CRISPR 系统实际是细菌的一种获得性免疫系统。细菌被 phage 侵染之后，可以获得 phage 的 DNA 片段整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，从对 phage 形成免疫。 1）早在 1987 年，日本人在大肠杆菌中发现有串联间隔重复序列。但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002 年才正式命名为 CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats). 2）随着测序技术和生物信息学的发展，2005 年，三个研究组同时发现间隔序列和侵染细菌的病毒或 phage 高度同源。从而推测，这一系统可能是类似于 siRNA 一样，是细菌抵抗 Phage 的一种机理。 （这些和植物的 siRNA, 高等动物的获得性免疫一样，都是获取入侵病毒的一个片段形成记忆，从而再次遭到入侵时可以对抗入侵的一种方式） 这中间还有很多故事（mark 先，待

凋亡是一种生理性、程序性的细胞死亡过程。在胚胎发育、组织器官形成以及衰老和病态细胞的清除中起重要作用。由于各种环境因素和遗传因素导致细胞失去发生凋亡的能力，是肿瘤发生与发展的关键因素之一，激发和恢复肿瘤细胞发生凋亡的能力，是肿瘤防治的有效途径。肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）是指在一种药物作用于肿瘤细胞而产生耐药性后，肿瘤细胞对未接触过的、分子结构和作用机制各不相同的其他化疗药物也产生交叉耐药的现象。MDR产生的机制非常复杂，研究表明凋亡逃逸（细胞抗凋亡能力提高）是其重要机制之一。本文综述产生凋亡逃逸相关的重要因子与MDR形成机制之间的联系，为克服MDR的研究提供参考。 1 P-糖蛋白介导的凋亡逃逸与MDR 目前对MDR产生机制的研究最深入的是对耐药细胞表达的药物转运泵P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）功能的研究。P-gp嵌插在细胞膜上，具有药物转运泵的功能，能将疏水亲脂性的药物泵出细胞外，降低肿瘤细胞内抗癌药的浓度，导致细胞毒作用减弱或丧失，并产生MDR。进一步研究发现，P-gp具有凋亡抑制作用，该发现为肿瘤耐药与凋亡耐受之间建

1、PCR括增的基本原理PCR (Polymerase Chain Reaction) 是体外高效复制DNA的技术，该技术几乎贯穿于现在分子生物学的各个领域。PCR体系由模板，特异性引物，高温聚合酶，脱氧核糖核酸几部分组成。反应过程分模板高温变性（Denaturation），引物与模板低温退火（Annealing）,引物在高温聚合酶的作用下延伸（Extention），在一定的条件下，退火和延伸可以合二为一。2、高温聚合酶分类高温DNA聚合酶主要用于DNA片段的高温快速扩增（合成），它以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和Mg离子存在时，在特定的引物引导下按5’-3’的方向合成DNA。目前，用于高温DNA合成聚合酶就其本身的特性分成三类：第一类酶具有5’-3’方向的DNA合成（聚合）性能，没有3’-5’方向的外切酶特性。如Taq DNA聚合酶及其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA聚合酶强，因为它不能纠正合成过程中出现的突变。第二类和第一类酶类似，它有合成特性，没有3’-5’方向的外切酶活性，即不具备保真性能。不同的是它们能以RNA为模板，合成DNA。也就是说它们具有逆转录功能。如

一、概念1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。二、建立细胞系（或株）的要求什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。2、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异

修仙分为五个阶段，一一对应如下： 炼气期———-大学 此时正式打基础的时期，无甚修为，也没有眼界，只能修炼一般的基础功法，除了同辈直接较量一下，各个门派也无甚差别，甚至散修也差不到哪里去。当然有灵根的弟子会被北大，清华等大门派吸纳，但是入门的惨烈争斗还是触目惊心的（高考）。 筑基期———-Ph.D在读时期 此时已经有了一些法力，可以指点炼器期的晚辈了。但是此时的门派差异性也已经初步显现出来了，进入名门大派的弟子有机会获得筑基丹的机会会多出散修不少，但又分为两种，一是直接赐予（报送）；二是参加血色试炼（考研），虽然后一种惨烈无比，但是回报也不错。结丹期——–Ph.D后期直到Postdoc 此时修为有了一些境界，可以修炼自己的内丹法宝了（论文），法宝威力越大（impact factor）日后立足的可能性就越大。不过散修（民科）是不可能到达这一阶段的，往往会走火入魔（胡言滥语，神经错乱）。此时的门派差异性大为突出，绝大多数的中土门派往往结丹微小，甚至结的是煞丹，根本无法修成正果。只有北大，清华，复旦，浙大，中科院这些名门正宗才有可能进入下一境界。（当然，也有不少小门派的个别老怪，修

一、目的： 建立DNP-9162型电热恒温培养箱标准操作规程，以保证DNP-9162型电热恒温培养箱的正确使用。 二、范围： 适用于DNP-9162型电热恒温培养箱操作的全部行为。 三、责任： 中心化验室对本SOP的实施全面负责。 四、内容： 4．1操作 4．1．1接通电源，将仪器电源开关拔到“I”位，此时电源指示灯亮，控温仪显示培养箱内当时温度。 4．1．2温度设定　当所需温度与设定温度相同时不需设定，反之则需重新设定。 　　4．1．2．1按控温仪的功能键“SET”进入温度设定状态，此时“SV”设定闪现。 　　4．1．2．2按移位键“ ”，并配合加键“△”或减键“▽”设定培养温度至所需温度。 　　4．1．2．3按功能键“SET”确认设定，温度设定结束。 4．1．3上限跟踪报警设定 　　4．1．3．1按功能键”SET”

bixin1220： 这几天做western条带出现了奇怪的现象。 band变成空心了，还有actin条带像PCR一样拉长了，请各位能人帮忙，指点谜径。 这是actin，我这是用细胞，分细胞质里的蛋白和细胞核里的蛋白做了western blot。细胞质里的蛋白actin就变成这样了，细胞核里的actin就正常。是不是我分得不对了就出现这种情况？我用RIPA buffer 提取蛋白的。 这是核里的actin。算挺正常吧 丁香园网友 bixin1220 认为： 在这儿写出我做western的条件，有什么该优化的地方，希望大家帮我指出来。 1.上样 一般30μg蛋白，volume一般不超过3μl。 2.电泳 stacking gel 70V，分离胶100~120V。 3.转膜 100V 1h。 4.封闭　5% 脱脂牛奶 2h。 5.凡washing TBST 　7~10