一、仪器设备：1.色析管柱（Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、铁架、铁夹及水平仪；2.部分收集器（fraction collector, 需准备干净试管约100 支）；3.浓缩用离心机（低速5,000 rpm）；4.浓缩用离心管Centriprep-30 （Amicon 4322）。二、药品试剂：1.胶体Sephacryl S-300 （Pharmacia）：（1）预先以缓冲液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。（2）胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。（3）Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。2.Buffer A-150：注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致。3.标准分子量组合（Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每组取0.4 mL。含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ova

用 途： 用于铜绿假单胞菌的选择性分离和培养。（GB/T 8538-2008） 原 理： 明胶胨和胰蛋白胨提供氮源；甘油提供碳源；硫酸钾和氯化镁可促进绿脓色素的产生；琼脂是培养基的凝固剂；萘啶酮酸抑制非假单胞菌的革兰氏阴性杆菌。 配方（每升）： 明胶胨　 16.0g

1.溶液I―溶菌液:溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2.溶液II-NaOH-SDS液:NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是稳定的。但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L,加抽提液时,该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA 与质粒DNA 的变性。SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸

从DNA水平上寻找确诊遗传病的指标或探讨遗传病和肿瘤的病因等方面，已取得很大成绩，对产前诊断，早期确诊和突变基因携带者的检出等都有重要意义。所用的方法大体有以下几种。 一、分离基因进行结构分析 利用DNA离体转化，制备探针，制备基因文库进行筛检，最后鉴定载体中插入DNA片段的特性等一系列技术，可以设法分离出目的基因或某一特定的DNA顺序。然后通过DNA核苷酸顺序分析可以弄清楚某些疾病的病因。比如，人体癌基因的分离和研究癌基因同原癌基因在DNA的结构与功能上的差别，对了解细胞癌变的机制起了很大的作用。分离目的基因或专一DNA顺序常用的是制备分子杂交探针，通过Southern印迹杂交或Northern印迹杂交等，了解某些遗传病基因结构上的差别，从而找到可靠的诊断方法。比如，患者的基因是否缺失，重排以及是否存在限制性片段长度的多肽现象等。 二、DNA限制性片段多态性连锁分析 DNA限制性片段长度多态性（restricition fragment length polymorphism, RFLPs）连锁分析法是指由于缺失、重排或碱

1、进入NCBI主页 在search后面选择Gene，在for后面填写需要查找的基因的名字。 点击“Go”， 出现了很多基因序列，在每个序列的右边还有“Order cDNA clone” 的链接，这些序列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是别名（Other Aliases）与你的目的基因一致，根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的IL6是标号为2的序列。 2.1、查找cDNA序列 2.1.1、点击Order cDNA clone, 出现目的页面如图所示： 2.1.2、点击Clone Sequence后面的链接即可得到cDNA序列。点击后如图所示（只抓取其中一部分）： 2.2、查找mRNA、蛋白序列 回到步骤1点击“Go”之后出现的页面，点击目的基因的名字，出现以下页面(只抓取相关部分)： 页面的下半部分，即可以获取mRNA和蛋白序列的部分： 找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分为几个板块，第一个“mRNA and ProteinMoon”区可以让我

制备单克隆抗体骨髓瘤细胞的选择 目前可用于制备McAb的骨髓瘤细胞系较多，这些细胞经药物8-AG、5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)或6-巯基鸟嘌呤(6-TG)诱导出酶缺陷型细胞系。如缺乏次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，因为HGPRT＋ 细胞利用8-AG后，合成毒性核苷酸而死亡，只有HGPRT- 细胞能在含8-AG的培养液中生长，或缺乏胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和次黄嘌呤-腺嘌呤磷酸核糖转移酶(HAPRT)等，这些细胞系不能通过补救途径合成DNA，只能通过主要途径合成DNA，因而对HAT敏感。 目前常用的小鼠骨髓瘤细胞系为SP2 /O和NS-1 ，X63Ag8.653等。均来自BALB/c小鼠骨髓瘤。刚复苏的瘤细胞需在含10％新鲜小牛血清的RPMI-1640培养液中，5％CO2 37℃ 孵箱培养。每2～3天换液一次，3～5天传代一次，待细胞生长稳定后方可供细胞融合用。生长良好的细胞，在倒置显微镜下观察为圆形明亮，排列整齐、形态完整，密度适宜(0.1～1×106 个/ml)。经台盼蓝染色，活细胞数应>90％。实验室培养的骨髓瘤细胞最好每隔3～6个月将细

实验室分成很多等级，而一般来说，在这个学术链条上，最高端的实验室就是国家实验室(National Laboratory).它一般由国家直接投资建设，进行的研究一般也是最重要的研究。作为世界上第一科研强国的美国，有一套完善的国家实验室制度，是美国学术界的顶梁柱，值得我们了解和学习。 美国的国家实验室一般隶属于联邦的政府部门，如能源部、国防部、NOAA(国家海洋和大气局)、 NASA(国家航空航大局)等，由联邦政府拨款支持。而实验室又一般交由知名大学来代管，这样大学可以借用实验室的财力，而实验室又可以从大学来获得人力。美国从20世纪上半期开始建立国家实验室制度，到了今大已经建设成了一个完善的国家实验室系统，在各个基础和前沿领域开展研究。 著名实验室 美国很多著名大学都为政府代管国家实验室，这些实验室的名字也就和大学连在一起了。最著名的如劳伦斯伯克利国家实验室(Lawrence BerkeleyNational Laboratory)。劳伦斯伯克利国家实验室位于美国加州大学伯克利分校，占地81公顷

流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统，激光源和光学系统，光电管和检测系统，计算机和分析系统。四大系统共同完成信号的产生、转换和传输任务。检测时将待测细胞或微粒制成细胞悬液，进行荧光染色后加入样品管中。以一定压力将待测样品压人流动室，在高压下磷酸缓冲液(鞘液)从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形流束(鞘流)，待测细胞在鞘液包绕下单行排列，依次通过检测区。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦后的光束，垂直照射在样品流上，当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心向空间360o 立体角发射，产生散射光和荧光信号。散射光包括前向角散射和侧向角散射。前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，反映细胞体积的大小。侧向角散射光对细胞膜、胞质及核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。经荧光染色的细胞受到适合的光波激发后产生的荧光通过光电转换器转变成电信号。最常用的光电转换器是光电倍增管。从光电倍增管输出的电信号需

【目的和原理】 平静呼吸时，胸膜腔内的压力（胸内压）(intrathoracic pressure)虽随呼气和吸气而升降，但始终低于大气压，称为胸内负压。若紧闭声门而用力呼气，在肺内压远高于大气压时，则胸内压可高于大气压而呈正压。倘因创伤或其他原因使胸膜腔与大气相通，因外界空气进入胸腔形成气胸(pneumothorax)，此时胸内压便和大气压相等，不再呈现负压，肺亦随之萎缩。本实验的目的在于学习测定胸内压的方法，并观察影响胸内压变化的因素。 【实验材料】 兔；兔手术台、哺乳动物手术器械一套、二道记录仪、血压换能器、张力换能器、铁支架、小滑轮、胸内套管（或粗的穿刺针头）、气管套管、50厘米长橡皮管一条、20毫升注射器；20％氨基甲酸乙酯。 【实验步骤】 生物秀模式生物与实验动物论坛 1.手术及实验装置 自兔耳缘静脉注入20％氨基甲酸乙酯（5ml/kg体重），待兔麻醉后仰位固定于兔台上。剪去颈部、右侧胸部和剑突部位的毛。在颈部正中线切开皮肤，分离出气管，插好气管套管。气管套管两侧

DGGE、CGGE及TGGE三种方法是基于相同的原理而设计的突变检测方法，它仍均是根据DNA的解链特性而设计。对于同一定序列组成或的DNA片段来说，它具有恒定的解链温度（Tm），但若其序列发生改变时，Tm值亦发生改变，在含有变性因素（变性剂，高温）的凝胶半进行电泳，当其比链解开形成分叉时，电泳迁移的速度就会改变。Tm值主要取决于DNA的碱基组成，序列中出现单碱基替换时，Tm亦发生改变，电泳迁移率亦改变，此即DGGE、CDGE及TGGE鉴定突变的技术基础。1、变性梯度凝胶电泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）DGGE是检测基因突变故为精确的方法，它不仅可检测单一片段的单点突变，对多点突变的检测亦较容易，该方法与PCR技术相结合，使其能非常快速的对大量标本进行分析。对于一DNA片段来说，其Tm值与基碱基组或有关，当其碱基组成发生变化时，Tm值亦改变，因此，对于突变的片段来说，若其在一变性物质线性梯度增加的凝胶上进行电泳时，随着变性剂浓度的增加，当这种浓度达一定值时突变的DNA片段发生解链而形成分叉，其电泳迁移速度变慢。因此突变的DN

死亡受体家族与诱导细胞凋亡的外在通路 死亡受体家族的发现是与肿瘤的治疗密切相关的。早在1868年，人们注意到某些肿瘤患者在受到细菌急性感染时肿瘤 会自然消退。后来，人们从细菌中分离到一种使肿瘤消退的毒素，即细菌内毒素(endotoxin)。用这种内毒素处理过的小鼠血液含有诱导肿瘤坏死的因子。1984年，Pennica首先克隆到编码这种血液因子的cDNA，即肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)。次年，Aggarwal等报道TNF的受体，揭开了对TNF受体膜蛋白超家族的研究。目前，这一大家族含有28个受体和18个配体。TNF受体超家族的成员都含有富含胱氨酸的胞外结构域(cysteine rich extracellular domain)。基于受体胞内部分不同，TNF超家族又分为两大类：死亡受体家族和非死亡受体家族。肿瘤坏死因子超家族在免疫与炎症反应中有重要作用，以下着重介绍与细胞凋亡关系密切的死亡受体家族。 (一)死亡受体家族(DeathReceptorFamily) 该家族的胞内部分都含有约80个氨基酸残基组成的介导凋亡区域，即死

一、实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。二、实验方法材料：小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养 液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮 罐，冻存管，冻存液，废液缸等。方法：（1）原代培

Western Blot 现在仍然是检测和分离蛋白最常用的一种实验方法，但是要想得到较好的结果并不容易，只有找到合适的实验条件并进行优化，才能以更少的时间得到更多的结果，达到事半功倍的效果！下面是 R&D Systems 品牌为您推荐的免疫印迹优化步骤和实验涉及参考数据：一抗浓度对实验结果的影响抗体：Human/Mouse/Rat RSK1 Antibody (Catalog # AF992)样本：人 HeLa 细胞 (Fig.1)A：5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 5% 脱脂奶粉，0.15 M NaClB：5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：0.2 mg/mL，溶于 5% 脱脂奶粉，0.15 M NaClFig.1脱脂奶粉及 NaCl 浓度对实验结果的影响抗体：Human PTP1B Antibody (Catalog # AF1366)蛋白分离：人 HeLa 细胞 (Lane 1)，MCF-7 (Lane 2) 和 TF-1 (Lane 3)(Fig.2)A. 5% 脱脂奶粉封闭，一抗浓度：1.0 mg/mL，溶于 2% 脱脂奶粉和 0.15 M NaCl

相关专题 质谱 技术在蛋白鉴定等实验中具有不可忽视的作用，不过，目前的应用还不是特别广泛。那么，有问题了怎么解决呢?本文收集了相关的新手对于这项技术的常见问题与解决方法。希望能更好地帮助大家了解这项技术。 问题1. 一级质谱和二级质谱有什么区别?什么时候做一级，什么时候做二级? 答：一级质谱鉴定的方式主要指胎指纹图谱(PMF)，即利用质谱仪精确测量酶解片段的分子量并搜库比较实现蛋白质 的鉴定，二级质谱是在一级质谱的基础上再选择部分肽段做进一步的破碎并对碎片进行深入分析和比较，鉴定出该肽段的序列并结合PMF的结果从而实现蛋白质的鉴定。二级质谱能够得到部分肽短的序列，具有更高的可靠性。随着现在杂志对数据的要求越来越严格，二级质谱鉴定是蛋白鉴定的大趋势，而且即使目前做一级质谱鉴定的结果，也需要挑选部分PMF结果做二级质谱验证。 问题2. 研究的物种不是模式生物 怎么办? 答：可以参考亲缘关系最近的模式生物做比对而实现蛋白质的成功鉴定，如果质谱图很好而没有鉴定结果说明这是一个全新的蛋白，可以采用de-novo等技术做深入分析与

相关专题 蛋白表达技术全攻略 很多朋友问这样一个问题：为什么毕赤酵母不表达? 他们自己也很纳闷，重组 酵母PCR检测也证明目的基因重组了，但是诱导之后就是在表达上清中检测不到目的蛋白，仔细研究操作手册后仍然不知道原因。 本人，根据自己的经验，采用倒推的方法，按实验过程从后向前分析，供大家参考： 1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白： 分析1：检测的方法是否有问题，要考虑是不是蛋白表达 量低而没有检测到? 如果是蛋白表达 低，可以选择浓缩蛋白，具体的方法很多，有TCA、丙酮、浓缩柱等等方法，之前在本版已经发过帖，在此不赘述。 2、如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到，那基本可以确证蛋白并不在上清中。那么蛋白到哪里去了，考虑是否没有分泌出来，而是在胞内，那就需要通过裂解酵母来检测胞内蛋白，具体的方法很多，在此也不赘述，曾整理过相关破碎的帖子。 3、如果胞内也没有目的蛋白表达 ，那么基本可以确定蛋白并没有表达。 4、为什么没有表达呢?倒推回来就是诱导的过程了，诱导体系是什么?甲醇浓

操作步骤：提示：（1） 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇！（2） 使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。（3） 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。1. 在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB，颠倒混匀，可轻弹管壁，确保混匀。2. 室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。3. 12,000 rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2，3。上清尽可能的吸弃，残留过多会稀释裂解液，造成裂解结合

Ⅰ.TTC法 一、原理TTC（2，3，5－三苯基氯化四氮唑）的氧化态是无色的，可被氢还原成不溶性的红色三苯甲月替（TTF）。应用TTC的水溶液浸泡种子，使之渗入种胚的细胞内，如果种胚具有生命力，其中的脱氢酶就可以将TTC作为受氢体使之还原成为三苯甲月替而呈红色，如果种胚死亡便不能染色，种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色，因此，可以根据种胚染色的部位或染色的深浅程度来鉴定种子的生命力。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：水稻、小麦、玉米、棉花、油菜等待测种子。（二）仪器设备：1. 小烧杯；2. 刀片；3. 镊子；4. 温箱；（三）试剂：0.12％～0.5％TTC溶液（TTC可直接溶于水，溶于水后，呈中性，pH7±0.5，不宜久藏，应随用随配）。三、实验步骤1. 将种子用温水（约30℃）浸泡2～6h，使种子充分吸胀。2. 随机取种子100粒，水稻种子要去壳，豆类种子要去皮，然后沿种胚中央准确切开，取其一半备用。3. 将准备好的种子浸于TTC试剂中，于恒温箱（30～35℃）中保温30min。4. 染色结束后要立即进行鉴定，因放久会褪色。倒出TTC溶液，再用清水将种子冲洗1～

1、概述HITACHI835-50高速氨基酸自动分析仪是八十年代初期由日立公司研制的产品，该仪器具有性能可靠、分析数据准确等特点，系统使用柱后茚三酮衍生法，一个分析周期只需72分钟。在全国测试分析行业中，该型号仪器拥有量较大。经过近二十年的运行，仪器已处于老化状态并进入故障多发期。为此笔者将自己在维修835-50过程中碰到的故障现象及采取的维修措施向大家介绍一下，以达到抛砖引玉之目的。2、仪器的组成该仪器由电气控制系统与液路控制系统组成。2.1 电气系统该仪器电气系统控制的核心是二片微处理器及相应的RAM、ROM及接口电路组成。一片是16位数据微处理器（IPC -16/500D），另一片是8位控制微处理器（SC/MP ⅡISP-8A/600）。16位数据处理的作用是进行色谱数据处理分析，包括ADC、TML 、PRN、AMP光电对数放大板、V/F，最终由色谱打印机打印出色谱图。8位SC/MP控制微处理器的作用，是控制泵1 、泵2 、电磁阀、自动进样器、磁卡读写机、循环水浴以及与16位数据处理器之间的通讯联络。2.2 液路系统主要由缓冲液罐、缓冲液泵及茚三酮泵、自动进样器、缓冲液分配器、氨

组织芯片申免疫荧光染色的定量分析 组织芯片(tissue chip)技术是一种快速、经济及高通量的现代组织化学技术。组织芯片又称组织微阵列(tissue mlcroarray，TMA)，它是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品粘贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上，形成组织微阵列。在同一反应条件下进行免疫组织化学染色，以了解病变组织与相应正常组织内蛋白质等抗原的细胞来源、分布特征和表达差异等。它的最大便利之处在于可以对大量组织标本同时进行检测，可缩短检测时间，减少不同染色样品间人为造成的差异，使得各组织或穿刺标本间对某一生物分子的测定更具有可比性。下面我们以实例简要介绍对组织芯片采用免疫荧光组织化学染色(Cy3探针标记)。 组织盘属蛋白酶抑制剂―1（tissue inhibitor of methalloproteinase-1,TIMP-1)广泛存在于各种组织中，在乳腺癌细胞中表达明显增加。采用免疫荧光组织化学技术(Cy3探针标记)对乳腺癌组织芯片中TIMP―1进行染色，并利用生物芯片扫描仪定量分析，可高效率地检测TIMP-1在大量乳腺癌组织中表达的改变。采用GeneP

（一）实验目的：学习细菌的鞭毛染色法（二）实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。（三）实验器材1.活材料：培养12-16h的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。2.染色液和试剂：硝酸银染色液、Leifson染色液、香柏油、二甲苯。3.器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。（四）实验方法1.镀银法染色（1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5—6天，使用前取出玻