论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助实验方法如下:第一步：制备组织裂解物1. 把组织剪切成细小的碎片。2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用 于后续实验。或1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。3. 每5mg组织加入300

1、【仪器名称】：精诺真活体成像系统。 2、【仪器型号】：IVIS 200。 3、【生产厂家】：美国精诺真（Xenogen，Inc.）公司（龙脉得生物技术有限公司代理）。 4、【检测适用范围】：用于提供LPTA动物模型靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可以用来评估候选药物和其他化合物的毒性。 5、【仪器使用优点、缺点】：IVIS 200是精诺真活体成像系统产品的最新型号，IVIS 200成像系统是由一个高度灵敏的CCD相机，特别设计的成像暗箱和成像软件组成。成像软件可以分析、组织和储存数据，成像软件为成像及分析提供了一个界面，它同时也是技术人员使用成像程序的向导，如相机控制面板的设定和所有成像变量的显示。软件为每一次使用提供一张图片作为数据结果，这是一张覆盖色彩的成像图片，记录了发射出的光子数据。图片中的颜色体现了单位面积中发射光子的数量，信号强度高的为红色，低的为紫色。这种颜色会根据光子数目范围进行细节上的调节。

刘默芳，王恩多 (中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，分子生物学国家重点实验室，上海200031) 摘　要：小分子调控RNA，包括siRNA (small interfering RNA)、miRNA (microRNA)和piRNA (piwi interacting RNA)、hsRNA (heterochromatin associated small RNA)等，是当前生命科学研究的前沿热点。越来越多的证据表明，这些小分子RNA 存在于几乎所有较高等的真核生物细胞中，对生物体具有非常重要的调控功能。它们通过各种序列特异性的RNA 基因沉默作用，包括RNA 干扰 (RNAi)、翻译抑制、异染色质形成等，调控诸如生长发育、应激反应、沉默转座子等各种各样的细胞进程。随着对这些小分子调控RNA 的发现，一些RNase III 酶家族成员、Argonaute 蛋白质家族成员及RNA 结合蛋白质等先后被鉴定为小RNA 的胞内蛋白质合作者，参与小RNA 的加工成熟和在细胞内行使功能。本综述简介一些RNA 沉默作用途径中重要组分的结构和

随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业（diagnostic industry），免疫分析向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”（real time clinical decision）和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析（dot immunobinding assay, DIBA），始于80年代。现介绍如下：一、两种模式1、班点免疫渗滤分析（dot immunofiltrtion assay, DIFA） 免疫反应是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行的（flow through type）。2、斑点免疫层析分析（dot immunochro-matography assay ，DICA） 分析原

一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 匀浆（Homogenization）低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质（即0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙）进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。分级分离（Fractionation）由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。二、细胞核的分离提取（一）操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖

【原理】 植物内源激素ABA（脱落酸）能使气孔关闭，降低叶片蒸腾速率，外源ABA也有同样的作用。可以用称量法、镜检法直接或间接地测量气孔开度，以检验外源ABA的作用，加深了解ABA的生理功能。 【仪器与用具】 显微镜1台（附接目测微尺）；温箱1台；感量0.001g天平；25ml烧杯6只；10ml移液管3支；剪刀1把；尖头镊子1把；光源；载玻片和盖玻片等。 【试剂】 100mg/L ABA：10μg ABA溶于100ml水中； 蒸馏水；无水乙醇； 10%醋酸纤维素丙酮溶液：称醋酸纤维素1g，加纯丙酮10ml溶解即可。 【方法】 1. ABA对小麦叶片气孔开度的影响 （1）取样 选择照光培养，生长均匀，约10天苗龄的小麦，取第一麦叶为材料，剪取长10cm切段共60段。 （2）设置处理 取6只25mL烧杯（直径尽量一致），分成三组，每组2只，按下表进行处理，即第一组每杯加蒸馏水10mL，第二组每杯加蒸馏水10ml和小麦叶片15段，第三组每杯加10mg/L的ABA溶液10mL和小麦叶片15段，均将叶片切段的基部插在溶

霸气侧漏的小号 最有趣的实验啊。我08年的时候在人人网（当时还是校内）上注册了50个账号，写了一个小程序放在服务器上维护着50个账号，账号按照以下规律生成： 规律零：所有50个账号全都互相不是好友，并且用了1个月的时间把好友数全都加到了500人以上。规律一：20个为完全虚拟账户，所有身份全是假的。20个为从网上找来的真实信息生成的账号，剩下10个是克隆现有的人人网账号。规律二：20个账号是我自己账号的好友，20个账号和我的好友关系在2层以外，10个账号和我不是直接好友，但是有共同好友。 规律三：25个账号是女性，25个账号是男性。规律四：20个账号采集我指定的开心网账号的信息进行更新，10个账号采集人人网上现有账号的信息，剩下20个随机从上面的内容你选择信息。（这条3个月后我觉得有点问题，我就改成了所有用户都是随机采集信息，并且都有固定的兴趣点。）上面的五个规律随机搭配生成50个账号。我做的事情只有一个目的，就是创造50个人。之后我做了两件事情，分别是09年正好一周年的时候，我在我人人网的大号上（有7000多个好友，10万+的访问）上发了一篇日志，说这个事情，把所有规则全都

生产企业必须能够克服大量的技术难题才能制备出能应用于诊断领域的免疫金复合物。 免疫金标记技术是一种将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内的许多蛋白质标记形成免疫金复合物的技术。虽然这种免疫金标记技术呈 现出多种多样的应用方式，但目前主要应用是以快速检测试纸盒的形 式使用于疾病的诊断和监测。1 在过去的十年里，基于膜上的快速诊断技术（包括侧向层析和渗滤两种形式）的发展为金标免疫试剂创造了巨大的市场。使用该技术 制备的标记物作为检测系统中的指示试剂使用在检测敏感症、传染病、 环境污染物、毒品、心梗标志物、早孕以及兽医等领域。2 如同其他标记结合物一样，获得成功的结果必须通过采用优质的试剂（蛋白质和胶体金）、丰富的生产经验和对标记物产品最终结果分析的完整的知识结构，这需要与免疫金产品使用 方法的终端客户培训一起进行。 蛋白质的标记 在体外诊断应用领域，通常采用抗原或抗体与免疫金结合制备免疫金结合物。采用单克 隆抗体或多克隆抗体，是影响抗体标记的因素之一。 虽然诊断产品中大多数抗体标记采用 IgG 抗体，但 IgM、IgE 和

问：想了解一下氨基酸的UV含量测定方法，是有关水蛭的！答：建议参考脑蛋白水解物（有口服用、注射用两种）的标准，测定“氨基氮”总量。我手里有口服用的标准（ws-xg-130-2002第16册324页）但没有电子版的，我把氨基氮的测定法给你敲一遍吧：本品每1g含总氮应为30～100mg，含氨基氮应为总氮的40％～50％。氨基氮 取本品0.5g，精密称定，置研钵中，加水30ml，研磨使充分溶解，用0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液，调节pH值至7.0，然后加入预先调节pH值9.0的甲醛溶液10ml，搅匀，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液pH值为9.0，按加入甲醛溶液后所消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的量（ml）计算。每1ml的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当与1.401mg的氨基氮。答：OPA:O-pathaldialdehyde,即邻苯二甲醛。强烈建议使用进口试剂（Sigma or Fluka）。OPA商品为固体粉末，溶液配制如下：10mgOPA粉末用0.1ml甲醇或乙醇溶解后加0.9ml 0.4N（pH 10.2）的硼酸缓冲液，然后加0.

流式细胞分析（flow cytometry，FCM）即流式细胞术，是用流式细胞仪（flow cytometer，FCM）测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。它凝结众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、发展直到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如电子技术、流体力学、计算机科学、激光技术、生物学、生物技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于它结合单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的应用有更加突飞猛进的发展。流式细胞术的发展史也就是各个相关学科的发展史的缩影。1、流式细胞术的发展历史1930年，Casperrsson和Thorell开始致力于细胞的计数；1934年，Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量；1936年，Caspersson等引入显微光度术；1940年，Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；1947年，Guclcer运用层流和湍流原

背景：本人即将研究生毕业，发了几篇SCI文章和参与发表几十篇论文，荣获过国家级奖励，主持编辑了实验室操作指南，参与主持过研究生学术活动交流，我是定向研究生（边读研边工作），而且导师是纯搞科学研究的老师，在这三年学习中，我基本学到了科学研究的真谛。因此，特借丁香园论坛与大家进行分享感受、交流经验。 一、科学研究的两个关键因素 1、科研思维：我老板一直跟研究生说“一定要做scientist，而不能做technician”，然而这一点往往在研究生教育阶段最容易被忽视。一般都是老板提出新idea，然后分工，每个研究生可能仅做其中某个环节或者是按照到导师的思路逐步去做，再加上研究生本身在实验操作上可能一开始就要花大量的时间去适用新环境和永远做不完的事情，可想而知，最终仅仅培养出一位“优秀技术员”，这在硕士研究生阶段尤为突出。但是，科研思维就像人体中的包含大脑的躯干，更加像是大海航行中的指南针，离开了他，最终科学研究将会停滞不前。 2、实验技术：有很好的idea，没有很好的实验条件和技能强的技术人员，科研思维也会变成“空想”。也许我们均没有国外实验室那样高顶尖的实验仪器，有的实验室还可能

1、 连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%

(一)细胞爬片的制备 (1)如果使用载玻片或盖玻片，必须在使用之前灭菌。可以一次灭菌并贮存在无菌状态下。如果使用少量的盖玻片，用金属镊子夹住盖玻片，在70%乙醇中浸泡，然后在火焰上烤干。要轻轻地镊取，以防破裂。为了方便起见，可以将盖玻片浸泡于70%的乙醇中，使用时放在火焰上处理。如果使用的盖玻片或载玻片数量较多，可以将它们放于专用的金属支架上，然后高压消毒。如果需要的数量更大，则可将其放在耐热的容器中，干烤2小时。 (2)在无菌状态下，把干燥的玻片放于适当的培养皿中。盖玻片可以用金属镊子镊取，圆形盖玻片可以放在24孔培养板的孔中，直径90mm的培养皿能够放入10-15张盖玻片，或者放入一张标准的载玻片。 (3)将悬浮的细胞放入组织培养皿中，培养至少24小时，让细胞贴附在玻片上。要想得到一个较好的结果，在加细胞时，密度应低，以防细胞密度过高。 (4)如果细胞数目有限，可把细胞悬液直接滴在玻片上，静置4小时后再轻轻加入培养液。通过这种方式，大部分细胞将粘附于玻片上，然后再培养约24小时，使细胞适当扩增。此时，取出载玻片或盖玻片可进行固定。 (二)细胞甩片的制

PCR技术简史一、PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。二、PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。三、PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时

基因芯片的基本原理 基因芯片 (gene chip)是目前生物芯片家族中最完善、应用最广泛的芯片，将许多特定的寡聚核苷酸或DNA片段(称为探针)固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面。运用缩微技术，基因芯片能够同时分析成千上万个生物样本，将许多不连续的分析过程集成于玻璃介质上，使这些分析过程连续化、微型化、集成化和自动化。其中最成功的典型基因芯片是在介质表面有序地点阵排列DNA，因此又叫DNA微阵列(DNA microarray)。 基因芯片的基本原理是利用杂交的原理，即DNA根据碱基配对原则，在常温下和中性条件下形成双链DNA分子，但在高温、碱性或有机溶剂等条件下，双螺旋之间的氢键断裂，双螺旋解开，形成单链分子(称为DNA变性，DNA变性时的温度称Tm值)。变性的DNA黏度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。当消除变性条件后，变性DNA两条互补链可以重新结合，恢复原来的双螺旋

做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。经过一段时间的浏览和学习，从一些在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享下。 以免疫组化实验为例来详述。 从我接触的很多本科生和研究生中发现，他们的确是免疫组化“新手”，他们只注重如何做和最终的结果，但对为什么这样做不太感兴趣。他们常按照网上所说的方法，摸索好的抗体浓度和条件后做出很漂亮的染色结果后，他们就认为自己已经掌握了免疫组化方法了，结果不求上进，更换一种新抗体后或实验出现异常结果后就很难做出来了。 当然，免疫组化对于我来说，做过很多，但也不能说什么都会，只不过我做的多了，失败多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的诀窍，拿来与大家进行分享。此外

一、导论 质粒提取的原理:转自复旦大学一位老师的帖子，后面是方法介绍 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？

相关专题 DNA连接与转化 胶回收方法全攻略 说到电泳凝胶的片断回收，想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实，一般在各个和分子 生物学沾到一点边儿的实验室里，从琼脂 糖凝胶中回收DNA，仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳 片断回收没有1—2个小时是搞不定的，每个实验室也有自己的独门秘诀，可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途，不同价钱的快速凝胶回收试剂盒，一下子将胶回收的时间缩短到10多分钟，操作也大大简化，胶回收就变成“小菜一碟”了。然而，从bbs逛上一圈下来，发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单的操作而烦恼。到底是什么导致了实验新手，甚至是老手在这个已经发展近40年的常规性实验中卡壳?由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验——比如酶切连接、转化筛选、测序 或者PCR 扩增、标记乃至显微注射等等，为大家搜罗各种产品和方法的优缺点，注意事项，做一个胶回收全攻略篇。 一、胶回收的关键参数 胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前

1. 实验目的 通过实验了解细胞凋亡的一般过程和形态特征，了解诱导细胞凋亡的因素；学习和了解细胞凋亡检测的常规手段，掌握利用梯状DNA电泳法鉴定细胞凋亡的方法。 2.实验原理 细胞凋亡是多细胞生物体在发育过程中或在某些环境因子的作用下发生的受基因调控的主动的死亡方式。对于生物体的正常发育、自稳平衡及多种病理过程具有极其重要的意义。细胞凋亡（apoptosis）的概念最早由Kerr于1972年提出，当时用来描述某些类型的细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，主动地结束其生命，最终脱落离体或裂解为若干凋亡小体（apoptotic body）而被其细胞所吞噬的过程。细胞凋亡的主要特征包括：染色质凝集、质膜出芽、核裂解及凋亡小体的形成。DNA特异性降解成180～200bp或其整数倍片断，通过凝胶电泳形成梯状条带，称为DNA Ladder。由于DNA特异性降解而产生大量3'-OH末端，可被末端脱氧核糖核苷酸移换酶介导的dUTP缺口末端原位标记法（TUNEL）标记，从而产生亮绿色荧光等。1980年，Wyllie在研究糖皮质激素诱导胞腺细胞凋亡时发现内源性核酸内切酶活化及其引起的

一、引物延伸分析（primer extension analysis） 引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA，长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2 pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。 1. 引物延伸分析所用试剂：引物延伸实验需要模板RNA，可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物，用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物，还需要反转录酶，AMV或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶试剂，和