一、实验目的 本实验目的了解PCR反应用来扩增DNA 特异性片段实验的的基本原理、实验方法和操作步骤，熟练掌握PCR反应基本体系配制和实验条件的设定。 二、实验原理 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。 PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增，主要过程如图6。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板;人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合;DNA聚合酶

实验（一）总氮量的测定——凯氏定氮法 [原理] 凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。 凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH 4 + 转变成NH 3 ，通过蒸馏把NH

血清脂蛋白是由血液中脂质与某些特异的蛋白质组成的一类不均一的复合物。因其所含脂与载脂蛋白的比例不同，其密度范围在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之间。纸电泳中显示四条带即：乳密颗粒，极低密度脂蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白。每种脂蛋白还可以分为更多的亚组分。用电泳法分离含载脂蛋白较高的组份（HDL，VHDL）比较成功，而离心分离法则适合用于各种密度的血清脂蛋白分离。一、梯度材料：血清脂蛋白密度较低，常用的梯度材料为Nacl,NaI,Kbr,KI等，常用的缓冲剂为ED。二、预分离：1、 血细胞与血清分离：　　离心参数：全血，角转头，3，000rpm×20min　　结果：沉淀为血细胞，上部为血清。2、 乳糜粒分离：禁食12小时以上人血浆中乳糜粒含量极少，已进食者因其血浆含乳糜粒高，应先离心去除乳糜粒。　　离心参数：4 ×10 (g×min),10°C.各种转头转速均可。　　梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆，上部1/4容积加0　　5MnaCl+0.3MEDTA,ph7.4　　结果：乳糜粒上浮，吸出。3、 血清蛋白分离：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白质。　　离心参数：（2。

在做病毒包装实验中，有科研工作者常遇到：用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功，有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒，从我们对不同载体系统病毒包装的多年经验总结，主要以下几个方面心得： 第一，病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统(尽量使用成熟的商业化载体系统)、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制(24、48 小时的细胞及荧光状态判断)、目的基因对病毒包装影响(基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功)。 第二，如果有细胞培养和细胞转染实验的常规经验，细胞因素应该没有什么问题(细胞培养人员一定要关注，包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀细胞密度适中否)，细胞产毒出毒期间过程中的活力是包装正常和出来的病毒滴度高低的一个重要环节(正常包装出病毒情况，慢病毒、逆转录病毒包装一个细胞出一个病毒颗粒，腺病毒是1000 个，腺相关病毒是10000 个)，所以实践操作表明，病毒包装转染时细胞的密度要控制，使得收毒(72 小时)时细胞密度在90%-95%左右。

pazj：我的细胞转染48h后在荧光显微镜观察，细胞形态还正常，消化传代以后加G418做稳转，加药以后头两天看，细胞形态还是正常的，但是第三天开始就缩小成小圆点了，感觉就和加胰酶消化后的细胞形态，不知道这个时候细胞是死是活？我还要继续加药吗？还是重新做转染？丁香园网友lanniaoxxx认为：这种情况应该是细胞死亡的形态表现。建议仔细回想步骤，并查找文献，重新做转染丁香园网友wlnju认为：如果细胞转染后48小时还可以的话，一般不是转染试剂的毒性影响。但是转染后的细胞传代时，状态会稍稍欠佳的第二，加G418筛选是比较常用的方法，我觉得你是不是之前没有筛选出G418的最小致死量？园子里有帖子，搜一下就可以了。一般的是将用浓度梯度的G418筛选正常未处理细胞10-14天，选出10-14天内，将所有细胞杀死的最小G418浓度。由于不同厂商不同批号的G418这个阈值是不一样的，所以你必须做试验前筛出这个浓度。我觉得你G418浓度不对。还有，加入以后，细胞是会出现大量死亡。丁香园网友wlnju认为：如果不放心，可以重新做一次，但这次的不要扔，继续培养。有克隆就行。丁香园网友lujun298认为：

1.转染技术介绍近几年，转基因研究已经成为分子生物学领域的研究热点，范围已经渗透到医学，农业等多个领域。在转基因动物的制备过程中需要经历基因克隆、细胞转染、胚胎移植等几个步骤，而细胞转染技术则是此过程中的重要环节。细胞转染技术是采用一定的方法和途径将外源核酸分子如 DNA、RNA 等导入特定的细胞并表达目的基因，产生特定功能的蛋白质分子。在生产转基因动物的研究中，通过结合细胞转染技术与体细胞克隆技术培育转基因动物是一条非常有效的途径。选择合适的细胞转染方法并进行优化，将会得到较高的转染效率，从而可以间接提高转基因克隆技术的效率。原代细胞难以转染是公认的问题，因此选择一种合适的转染试剂，提高原代细胞的转染效率，是后续阳性细胞的筛选、核移植试验以及转基因动物产生的重要前提。目前最为常用的转染方法有脂质体转染法、磷酸钙转染法、电穿孔法、病毒介导的转染等。据报道病毒介导的细胞转染技术是目前常用的转染方法，慢病毒载体可以作为一种有效的基因运载工具，并能够在胞内稳定表达。阳离子脂质体作为一种有效的基因传递载体具有下列特点：对细胞类型有选择性，转染效果随细胞类型变化大，对 DNA 的质量要求高，但操

HE切片应该是红蓝相映，层次浓淡均为分明。 一、石蜡切片苏木素一伊红染色法的基本步骤： 脱蜡 （1）二甲苯I 15分钟 （2）二甲苯II（应完全透明） 10分钟 逐级降浓度酒精水化 （3）无水酒精I（变为不透明） 1－2分钟 （4）无水酒精II 1－2分钟 （5）95% 酒精 1－2分钟 （6）80% 酒精 1－2分钟 （7）自来水洗 片刻 染色 （8）蒸馏水 片刻 （9）苏木素液染核 10—15分钟 （10）自来水洗 片刻 （11）1%盐酸酒精分化 0.5—1分钟 （12）流水冲洗 片刻至数小时 （13）碳酸锂饱和水溶液反蓝 1分钟 （14）流水冲洗 15分钟至数小时 （15）复染 0．5％伊红水溶液（对比染色） 2—5分钟 逐级升浓度酒精脱水（若为醇溶伊红可直接人90％酒精） （16）自来水洗（分化伊红） 片刻 （17）95％酒精I 1－

一、 实验目的 掌握观察与鉴别X染色质的简易方法，识别其形态特征及所在部位，为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件。二、 实验原理 1、发现1949年，加拿大学者Barr等人在雌猫的神经元细胞核中首次发现一种染色较深的浓缩小体，而在雄猫则没有这种结构。进一步研究发现，除猫外，其他雌性哺乳动物（包括人类）也同样有这种显示性别差异的结构。而且不仅是神经元细胞，在其他细胞的间期核中也可以见到这一结构。称之为巴氏小体，也称为X染色质。正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深，大小约为1微米的三角形或椭圆形小体，即X染色质。间期核内X染色质的数目总是比X染色体的数目少1。正常女性有两条X染色体，因此只有一个X染色质；若有三条X染色体，就会有两个X染色质，余此类推。正常男性只有一条X染色体，所以没有X染色质。2、莱昂假说为什么正常男女之间的X染色质存在差异？女性两个X染色体上的每个基因座的两个等位基因所形成的产物，为什么不比只有一个X染色体半合子男性的相应基因产物多？为什么某一X连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？1961年，Mary Lyon 提出了X染色体失活

方法一：效率非常高，一般可到1undefined8，好时可到1undefined9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。实验试剂：A液：1M，MnCl2B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。实验步骤：1、 划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时。2、 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时。3、 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多。4、 每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮。5、 加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。6、 用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用

细胞程序性死亡是正常生理现象，多发生于胚胎发育和维持组织自身平衡。Kerr et al.最早发现有两种细胞死亡：坏死（Necrosis）和凋亡（Apoptosis）。Apoptosis，希腊文意思是树叶从树上“凋落”，这里是指凋亡，是细胞主动参与自身死亡的过程。凋亡程序有一些特殊形态学特征，包括质膜的改变，如细胞膜不对称性和细胞附着消失，胞浆和细胞核固缩，核内DNA裂解。到了晚期，凋亡细胞断裂成“凋亡小体”，并很快被巨噬细胞清除，而不会引起周围细胞的炎症损伤。坏死，通常是由细胞损伤或细胞毒物作用引起，在形态学和细胞生物特性上，与凋亡有着本质的区别。坏死细胞的早期变化是细胞和线粒体肿胀，继而细胞膜破坏。不同于凋亡的是，坏死的细胞胞质内容物（多为蛋白水解酶）释放，会引起周围组织的炎症反应。病理情况会引起细胞异常凋亡，如Alzheimer氏综合症、Hodgkin氏综合症、移植物抗宿主性疾病、移植排斥、自身免疫性疾病、肿瘤、AIDS等。随着对凋亡机制的深入了解，越来越多的凋亡检测方法得到了发展和应用，应根据细胞或组织类型、凋亡诱导途径的不同，选择最佳的实验方法。凋亡最早的特征变化之一就是出现了

I 型速发型超敏反应机制 速发型超敏反应的发生包括两个阶段：①速发相反应：活性介质作用于血管、平滑肌；②迟发相反应：白细胞的募集及发生炎症。 1．速发相反应(immediatereaction) 在速发相的致敏阶段，外源抗原包括变应原或病原体进入机体，被APC摄取，在细胞内被降解成肽段，再与MHCⅡ类分子结合，一起提呈到细胞表面供丁细胞识别。CD4 T辅助细胞(Th)的表面的抗原受体(TCR)可识别与MHC分子结合并表达于细胞表面的抗原肽而活化，活化后的Th细胞启动抗原特异性细胞和体液免疫应答，促进B细胞产生IgE类抗体。致敏个体产生的IgE分布于全身，在外周组织中通过高亲和力的IgE受体与肥大细胞和嗜碱粒细胞结合。 在激发相阶段，相同变应原再次进入机体后，与已经致敏的肥大细胞或嗜碱粒细胞表面IgE抗体特异性结合，使得IgE分子发生交联，触发致敏靶细胞释放多种介质。这些介质的生物活性主要是：促进血管扩张、增加血管通透性、增进平滑肌收缩，从而引发“速发性反应”。 局部毛细胞血管内血浆的渗出出现水肿，这种轻微的水肿称为荨麻疹，在皮肤上可形成直径为

概述 cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。 cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都仅有15%左右的基因得以表达,产生约1500

生物实验中发生的一些化学反应十分激烈，因此在整个实验过程中潜伏着发生各种意外的因素，实验人员在思想上要重视，需具备必要的实验中化学试剂安全知识。化学药品大致分为二类，一类是具有刺激性腐蚀性药物，一类是有毒化学药品。（1）毒物某些侵入人体的少量物质引起局部刺激或整个机体功能障碍的任何疾病都称为中毒，这类物质称为毒物。根据毒物侵入的途径，中毒分为摄入中毒、呼吸中毒和接触中毒。接触中毒和腐蚀性中毒有一定区别，接触中毒是通过皮肤进入皮下组织，不一定立即引起表面的灼伤，腐蚀性中毒是使接触它的那一部分组织立即受到伤害。毒物的剂量与效应之间的关系称为毒物的毒性，习惯上用半致死剂量（LD50）或半致死浓度（LC50）作为衡量急性毒性大小的指标，将毒物的毒性分为剧毒、高毒、中等毒、低毒、微毒五级。上述分级未考虑其慢性毒性及致癌作用，我国国家标准GB 5044-85《职业性接触毒物危害程度分级》根据毒物的LD50值、急慢性中毒的状况与后果、致癌性、工作场所最高允许浓度等6项指标全面权衡，将毒物的危害程度分为1-Ⅳ级。（2）刺激性腐蚀性药物这类药物有的有刺激性，对眼睛、粘膜、气管有刺激作用，腐蚀损害皮肤、组

RT-PCR简介 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。使用天为时代公司的总RNA提取系统（如目录号 DP405和DP406），所获得的RNA的纯度高，基因组DNA污染少，用于RT-PCR系统可得到满意结果。 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 RT-PCR引物的选择 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。

一、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察(一)原理在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都是由一层单位膜包围而成。软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。(二)方法取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓，剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄部分的一小片，放在载片上，滴两滴1/3000中性红染液，染色8～10分钟，用吸水纸吸去染液，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余Ringer氏液。(三)结果显微镜下观察，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色。大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。二、大白鼠胫骺软骨细胞电镜照片的观察动物细胞液泡很小，即使是活体染色也只能看出是一个小点，为了进一步看清液泡的结构我们有必要观察软骨细胞的电镜照片。大白鼠胫骺骨细胞电镜照片，细胞核与核仁很清楚，细胞质中有丰富的粗面内质网，液泡系

药理学实验 利尿药对动物尿量的影响 【目的】观察药物对尿排泄量的影响，了解利尿试验方法。 【原理】呋噻米具有利尿和扩血管作用。本实验采用导尿管法，观察呋噻米的利尿作用。 【器材】 婴儿称、兔固定台、导尿管、注射器、量杯、兔开口器等。 【药品】 1%速尿（呋噻米）、5%葡萄糖生理盐水（水负荷用） 【动物】 家兔 【方法】 1.取雄性家兔1只，称重，固定在手术台上，尿道插管（插入8～10cm），轻柔腹部将余尿排尽。 2.灌胃给水负荷(5%葡萄糖生理盐水)30ml/kg,30min后收集15min尿量（胃管插入26～28cm）。 3.耳缘iv1%速尿0.4ml/kg，然后收集15min尿量。 【结果】 填入表9-1、2。 比较动物给药前后尿量的差异，用配对t检验。计算公式 ： 自由度（f ）=n-1 式中 为前后差数的平均值， 为差值的标准差，n为动物数。 表 9-1 利尿药对动物尿量的影响 组 别

1、打开电源、稳压器、打印机、工作站、主机。2、工作站选择MS-DOS方式下操作，进入AFS系统。程序自检，全部出现PASS，同时听到“咔嗒”响声。3、按正确方向插上A、B道灯，用调光器调整光路，打开自动进样系统。4、按键，选定负高压，加热温度、炉高、A、B灯电流、载气流速、屏蔽气流速，按点火，预热30分钟。5、按键，输入A、B道标准曲线点的浓度（由低到高），输入A、B道标准曲线点的浓度；选择积分方式、A、B道的单位，读数时间、延迟时间、进样量及重复次数。6、按键，选择泵1、泵2速度，设定各种样品在进样盘上的位置。7、按键，输入样品个数、编号、状态、配标准曲线、配硫脲、配抗血酸、样品消化处理、取样、按ISE 设定的编号放置。8、在液槽中加入10%HCl，打开气瓶、排风扇，连好自动进样接头、连好各接管、检查无漏、压上压块、开盖检查水封、加蒸馏水、按键，调成Auto/on，再按键，F4Start开始测量。9、打印。10、关机步骤（1）用纯水代替所有溶液运行清洗。（2）关气。（3）关自动进样系统、关主机、退出工作站、关打印机、放松压块、拔下进样器、关排气扇、关稳压器、关电源。

变性梯度凝胶电泳DGGE操作步骤： 1、将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。 2、共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在3、在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。 4、反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如1undefined16cmgels(1mmthick)：设体积调整装置到5、配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。 6、每管加入80μl10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有‘

【原理】Southern 印迹是将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程。DNA 分子经限制性核酸内切酶酶切，经琼脂糖凝胶电泳将得 DNA 片段按分子量大小分离，然后将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶变性，并将单链 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜或其它固相支持物上，而各 DNA 片段的相对位置保持不变，这种滤膜可用于杂交反应。利用 Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析 (RFLP)等。【操作】(1)取一定量的待测 DNA 样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA 的量根据样品的种类及目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取 0.1 ～ 0.5 μ g 即可；而对于鉴定基因组 DNA 中的单拷贝基因顺序，则需要 10 ～ 20μg ；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要多至 30 ～ 50 μ g 。酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳，在其中 1 孔中加入适当的 DNA 分子量标准参照物。电泳结束后，溴化乙锭 (EB)染色，长波紫外线下观察电泳结果，用 1 张保鲜膜覆盖在

一、RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 二、RT-PCR具体步骤 详细参考：RT-PCR 1. 总RNA的提取 见“总RNA的提取”相关内容。 2. cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 （1） 在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，轻