1.　ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2.　ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要

请规范发贴，谢谢合作。应用改良ELISA法检测某蛋白，购买标准的抗原肽，分子量比较小，直接包被标准的抗原肽，浓度已经达到了100ng/ml水平，过夜后经过洗涤，然后加入一抗，为纯化的IgG，浓度也比较高，为μg/ml水平，按着标准抗原肽和IgG的分子量来计算质量浓度，一抗应当足够和抗原肽结合了。加入一抗后37℃温育2h，洗涤，然后加入标记物（二抗），37℃温育1h，洗涤，再加入TMP底物A和底物B，显色反应20min，加入反应中止液，中止反应后在酶标仪上于450nm处测定OD值。OD值显示：高浓度标准抗原肽128ng/ml时OD值比较高，64ng/ml的OD值尚还可以，但是接下来的OD值均相当低，所有在作标准曲线时很难得到比较理想的相关系数，因为浓度比较小的抗原肽的OD值几乎相等，后面几点差不多在同一水平线上。而样本中的被检测蛋白的含量本来就比较低，所以灵敏度不够高，不知道该如何提高这种ELISA法的灵敏度？具体的实验步骤及试剂如下：1、包被液稀释的抗原（4、8、16、32、64、128ng/ml），用移液器小心将抗原液100μl加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可产

在现代生物医学研究及临床应用领域，酶联免疫吸附检测术（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）的使用越来越广。在免疫学研究中，常见的ELISA应用包括检测体液或培养液中抗原（如细胞因子）或抗体的浓度。虽然ELISA技术的操作流程因具体实验目的不同而有差异，其基本思路均是先将已知抗体（或抗原）固定于酶联反应板上，利用抗原-抗体特异性结合的特点，使待检测样本中相应的抗原（或抗体）联结在酶联板上，然后利用针对待检测抗体或抗原的抗体及随后的酶促反应，测定样本中抗原（或抗体）的浓度。操作过程中颇为费时费力的是各步之间的洗板过程。虽然目前有自动化洗板仪器商供，但普通实验室通常并不置备。在小规模的实验（如只有一块酶联板）中，手工向各反应孔中加入洗液（含0.05% Tween的PBS缓冲液）尚可行。但如有较大规模（如5-10块酶联板）实验，即使使用多道移液器吸加洗液也很易使人疲劳。本文以使用商业试剂盒检测人IL6和自行检测小鼠血清中抗体为例，介绍ELISA的一种简便操作方法。人IL6检测试剂盒为eBioscience公司（San Diego, CA, USA）的

ELISA中常见问题及解决方法ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。下面分析Elisa试验操作中可能影响结果的原因，并给出相应的解决办法1 选择试剂 选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。2 加样 可能原因： 1）血清或血浆标本分离不好即进行加样； 2）手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)； 3）加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。 解决办法： 1） 标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。 2) 加样后及时放入孵箱。 3) 加酶试剂后用吸水纸在酶标

ELISA技术的-操作要点　优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。4.1 标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血

ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。 ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。引起ELISA测定错误结果的原因主要有：

ELISA的原理和类型1.　ELISA的原理　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2.　ELISA的类型　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法

LISA技术的-操作要点 　优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。4.1 标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

检验技士考试辅导 2011年ELISA测定临床标本的收集和保存 　用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面|： 　　（1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如

ELISA实验质量控制问题BIOX.CN 2004-9-7 14:52:52来源：生命经纬　　从1949年美国College of American Pathologists（简称CAP）首先开始研究临床实验室室内质量控制（简称质控）问题，美国学者Levery和Jenning于1950年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉序幕。　　到70年代，实验室质量控制进入一个新的阶段--全面质量管理，推行GoodLaboratory Parctice（简称GLP）。进入80年代末期，GLP的统一标准产生了，发展到"认证实验室"管理阶段。　　全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。　　本章节主要介绍免疫学检验的统计学室内质控方法。因为ELISA是目前临床上最常用的一种免疫学检验方法，就以ELISA检验为例，介绍一下有关问题。　　卫生部临床检验中心免疫质控室从1988年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验的质量评价活动，一直采用这一套质量评价方法，并在实践中不断实践、提高和完

杨晓芳 张英（新疆昌吉州人民医院检验科　新疆昌吉　831100） 【关键词】ELISA法孵育时间丙肝抗体假阳性 酶联免疫吸附试验(ELISA)，以其操作简便、快速、灵敏度高、特异性好之特点。被广泛应用于临床诊断，是目前检验科用于各类传染病指标大批量标本检测的主要方法，也是丙肝抗体常用的检测方法，但由于酶联免疫吸附试验(ELISA)，在检测过程中影响因素诸多，会出现假阳性反应，现将ELISA两步法由于孵育时间不同，而导致假阳性结果报道如下： 1　材料和方法 1.1标本来源本院住院病人血清。用真空采血管采集病人全血5mL，3000转离心15分钟。分离出血清备用 1.2试剂酶联免疫试剂盒为：北京金豪制药股份有限公司提供（批号20100812，20102165） 上海科华生物工程股份有限公司（批号201012021） 中山达安基因有限公司（批号2010004） 1.3仪器美国宝特Bio-TekELX800型酶标分析仪。英国INTEC公司INTEC1000洗板。 LightCycler型核酸扩

优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 1 标本的采取和保存 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本

作者：肖静 作者单位：850007 西藏拉萨，西藏军区总医院检验科 在使用ELISA试剂进行血液HBsAg、HCV、HIV及梅毒等各项检验的过程中，经常发现空白和阴性、阳性对照以及室内质控孔(卫生部临检中心提供，HBsAg 0.5ng，1ng;HCV、HIV、梅毒均为2NCU)结果正常，而血液标本孔的OD值却比较高(大多数OD值≥0.070)。标本的阳性率很高，每板除对照孔外，有时阳性高达10孔之多，而大多数真阳性标本都出现弱阳性结果。这就是试验中所说的“花板”问题。这种现象对检验结果的正常判断造成了很大的影响。笔者在试验中，针对这种“花板”现象进行了认真的分析及判断。总结如下。 　　1 标本、试剂、仪器 　　1.1 标本 2008年1—12月无偿献血人员的血液标本。 　　1.2 试剂 HBsAg、HCV、HIV、梅毒试剂均为不同厂家的ELISA试剂。 　　1.3 仪器 LD4-2型离心机，BID RAD1575型洗板机，BID RAD550酶标仪。 　　2 方法 　　所有无偿献血人员的血液标本，按照各个厂家提

间接ELISA 1．溶液准备： 包被液：50mM Na2CO3 （ pH9.6 ）, 20mMTris-HCl （ pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ） 封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等 洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 （ pH7.4 ） 　　 2．实验程序： 　　1 ） 将抗原按适当浓度溶解于包被液中。 　　2 ） 在对应的孔中加入100μl抗原，室温孵育2h或4℃过夜。 　　3 ） 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。 　　4 ） 每个孔中加300μl封闭液，孵育1h。 　　5 ） 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。 　　6 ） 每个孔中加100μl一抗，37℃孵育1h或室温孵育3h。 　　7 ） 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 　　8 ） 每个孔中加100μl二抗，室温孵育1h。 　　9 ） 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满

1.1 抗体的酶标记及质量鉴定 本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。 标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算免疫球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。 1.2 包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化 1.2.1 包被缓冲液的优化 包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mM ph9.6 ）、磷酸盐缓冲液（50mM ph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50 mM ph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：400及1：300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统（表5）。同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。 1.2.

1 抗体的酶标记及质量鉴定 本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。 标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算免疫球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。 2 包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化 2.1 包被缓冲液的优化 包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mM ph9.6 ）、磷酸盐缓冲液（50mM ph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50 mM ph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：400及1：300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统（表5）。同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。

基本原理 　　1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 　 方法类型和操作步骤　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂

□本报记者 张思玮 “标准化的检测系统建立是分析中质量管理的核心，一定要强化检测系统的概念，重视不同检测系统对同一标本检验结果的可比性。而目前，国内的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测并没有实现标准化，如何从理念上、设计上、硬件设置上实现ELISA检测标准化便成为了当务之急。”我国医学实验室与体外诊断标准委员会主任委员（TC/136）、解放军总医院丛玉隆教授说。 3月12日，由吴阶平医学基金会组织的“医学实验室ELISA标准化研究”课题项目专家论证会（以下简称“论证会”）在北京举行，卫生部临检中心李金明教授、解放军第302医院临床检验医学中心主任毛远丽教授、北京军区总医院检验科主任王北宁教授、上海交通大学附属新华医院沈霞教授等近20位检验医学领域的专家参加论证会。 ELISA是目前国内临床检验科室最为常用的免疫检验方法，常用于一些重要检测项目如传染病或感染性疾病病原体的抗原和特异抗体、肿瘤标志物等常规检测，其检测结果的精准度直接影响到临床诊断、治疗检测和预后评估。 “要保证检测结果的精准度，实现在不同实验室间检验结果的一致性，检

近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。 方法种类 比较指标 ELISA RIA IFA 敏感性 高 高 较低 特异性 取决于抗原制备 同左 较高 重演性 尚满意 尚满意 尚满意 结果判断 客观 客观 有主观因素 抗原制备 较容易或复杂 同左 较容

作者：李荣 作者单位：(广西玉林市中心血站，广西 玉林) 【摘要】 目的通过对血液标本使用全自动加样系统在酶联免疫吸附测定(ELISA)实验中出　　现的拖带现象进行分析，寻求有效的解决拖带现象的方法。方法用Freedom EVO Clinical和ML-STAR全自动加样系统加样，对ELISA实验出现拖带阳性的标本，采取手工加样用原试剂盒进行双孔复试，比较两种加样方法的检测结果。结果经手工加样ELISA双孔复检，结果均为阴性，证实为拖带阳性。结论拖带现象是由全自动加样系统加样针污染引起的，做好对仪器的维护保养可以减少拖带现象的发生，而最好、最根本的解决办法是使用一次性加样针。 【关键词】 全自动加样系统;酶联免疫吸附测定;拖带现象;设备污染 　全自动加样系统在血站的使用日趋普及，但目前使用的多为固定加样针，这样分配位置在前的样本会使其后的样本出现不同程度的污染，引起假阳性或假阴性，也就是通常所说的拖带现象。拖带现象会导致大量标本待检或试验重做，这样不但增加了工作量，浪费试剂，更为严重的是有可能导致阳性标本的漏检，影响检验质量。现将本站43 2