免疫组化常见问题的处理当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。对照/标本无染色① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。⑧ 检查冲洗液

一、非特异性染色的识别常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。二、非特异性染色的原因1. Ig与Fc受体结合多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。避免方法：① 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片；② 用不含Fc段的抗体，但价格贵（V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化）2．静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。避免方法：① 尽量稀释一抗② 降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；③ 用去垢剂 如triton-100处理切片。 Tween-20等；3.二抗与组织中的Ig结合如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越明显，如人与猴，兔与豚鼠。避免方法：用与待测组织相同的5%的正常血清稀释二抗。如人血清。4．组

免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事，但最基本的应从以下方面加以注意： （1） 去除内源酶及内源性生物素　 一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中自身含有一定量的内源酶和内源性生物素，而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活，以保证免疫组化染色在特异性情况下进行。 1) 去除内源酶　 常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。但在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响，但用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别，而且此方法比较通用易操作，但应注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%一5%，

(一)　基本原理 　　APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 技术的基本原理为: 抗鼠IgG抗体作为桥梁，将鼠源性识别细胞 抗原的第一抗体与鼠源性的抗碱性磷酸酶单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物相连接，使之成为Ag，-Ab１－Ab２-anti AP-AP的复合物。还可通过二抗将APAAP 复合物重复叠加起来，从而使多个碱性磷酸酶标记于组织细胞 上第一抗体所识别的抗原部位，提高了敏感性。 　　　　　　　　　　图　　APAAP技术原理 　　(二)　方法 　　 分离外周血单个核细胞 (PBMC)，洗涤后用含10％FCS�PMI1640 调整细胞 浓度约5×10６／ml 　　　　↓ 　　　　　自制制片机上制片，充分干燥 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　用含丙酮-福尔马林固定液中固定30秒钟 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　　自来水、蒸馏水依次冲洗 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　用TBS稀释特异性McAb

免疫组化（LP法）操作步骤是医学检验技士考试所涉及的内容，医学教育网整理如下，供广大医学检验技士考试考生参考学习。 1.切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行 2.缓冲液洗3min/2次。 3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在HydrogenPeroxideBlock中孵育10-15分钟。 4.缓冲液洗5min/2次。 5.滴加UltraVBlock，在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。 （注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5-10%正常羊血清，这一步可以省略。） 6.缓冲液洗5min/2次。 7.滴加一抗工作液37℃孵育1-2小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）医学教育网 8.缓冲液洗5min/2次。 9.滴加PrimaryAntibodyEnhancer（增强子），在室温下孵育20分钟。 10.缓冲液洗5min/2次。 11.滴加HRPPolymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。 （注：HRPPolymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中

1、染色过强 原因 解决办法 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温 1 小时或 4 ℃过夜 孵育温度过高，孵育温度超过 37 ℃ 一般室温 20-28 ℃ DAB 显色时间过长或 DAB 浓度过高 显色时间不能超过 5-10 分钟，以显微镜下观察为准 2、非特异性背景染色 原因 解决办法 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗 3×5

免疫组化-石蜡切片的染色 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶

免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 ( 荧光素、酶、金属离子、同位素 ) 显色来确定组织细胞内抗原 ( 多肽和蛋白质 ) ，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行 IHC 染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子

免疫组化的经验总结--操作要点和技巧 1 固定：最好用 4% 的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。 Bouin S 固定液：饱和苦味酸 750ml ，甲醛 250ml ，冰醋酸 50ml ，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。 PLP 液：即高碘酸钠 - 赖氨酸 - 多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 2 ．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。 3 ．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。 4 ．烤片： 60℃ 30 分钟或 37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。 5 ．蜡块及切片的保存：最好在 4℃ 保存 6 ．脱片问题： Poly-L-Lysine( 多

免疫组化实验的要点和技巧 1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，

　　（1）切片入PBS冲洗5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。 　　（2）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。 　　（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。 　　（4）1μg/ml蛋白酶K，37℃保温30min。 　　（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。 　　（6）PBS冲洗2×3min。 　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。 　　（8）2×SSC冲洗10min。 　　（9）杂交：如是cDNA探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液10μl于切片上，盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜，3H标记探针每10μl杂交液含1×105cpm探针，32P或35S标记探针每10μl杂交液含5×105cpm探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后43℃保温12～16h。 　　（10）4×SSc 37℃冲洗10～30min。 　　（11）2×SSC（如为RNA探针则含20μg/ml RNas

实验试剂 1. PBS缓冲液(pH7.2～7.4)：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2 HPO4 4.3mmol/L， KH2 PO4 1.4mmol/L。 2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH6.0，1000ml)：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3. 0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0)：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2 O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml。 4. 1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0)：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml。 5. 酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2 (pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6. 3%甲醇-H2 O2 溶液：用30%H2 O2 和80%甲醇溶液配制。 7 封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0～9.5)等量混合；b、油和TBS(或PBS

实验试剂 PBS，0.5%Triton X-100(DPBS配)，3%H2 O2 ，封闭血清 (5%正常二抗血清DPBS液)，一抗(PBS配，滴度1：200，湿盒)，二抗工作液(湿盒)，C液(湿盒)，DAB显色液，苏木素，树胶 实验设备 20mm盖玻片，90mm培养皿，电子显微镜 实验步骤 1. 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2×104 /ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2. PBS清洗标本 3次各 1 min。 3. 冰丙酮固定 15 min。 4. 空气干燥 5min。 5. PBS清洗标本 3次各 2 min。 6. 0.5%Triton X-100(DPBS配) 孵育 1次 20 min。 7. PBS清洗标本 3次各 2 min。 8. 3%H2 O2 孵育 15 min。 9. DPBS清洗标本 3次各 2 min。 10. 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS

二步法：EnVision System EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即 EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。 EnVision工作程序： 1） 脱蜡、水化组织切片。 2） 预处理组织切片（据一抗具体说明而定） 3） 蒸馏水漂洗，置于TBS中。 4） 阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP） 5） 蒸馏水漂洗，置于TBS，10分钟 6） 一抗孵育10-30分钟 7） TBS漂洗10分钟 8） EnVisionTM孵育10-30分钟 9） TBS漂洗10分钟 10) 色源底物溶液孵育10分钟 11) 蒸馏水漂洗 12) 复染及封片 免疫染色方法 The basic principles of ICC • 抗原抗体反应 • 标记化学反应 • 呈色化学反应 要求 待检标本形态结构 和抗原性保存良好, 抗原

实验原理 SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。 亲和素(Avidin)存在于鸡蛋中，分子量67000。是一种碱性蛋白质，具有对生物素近乎于共价键的结合力。链霉亲和素是一种从链霉菌(Streptomyces Avidinii)培养物中所提取的蛋白质，分子量47000，不含糖链，等电点IP=6.0-6.5。和亲和素一样，也有四个生物素结合位点，亲和力高达10-15M。和亲和素相比，链霉亲和素更为完美。现在经过改进的亲和素等电点IP可以达到7.0，明显地消除了原碱性蛋白特征所引起的非特异性吸附。 生物素是一种水溶性维生素(即维生素H)，分子量244。生物素活化后，可以标记抗体和酶而不影响其活性。链霉亲和素—酶复合物可以起到放大信号的作用，这是SABC具有高度敏感性的基础。 SV(Super Vision)两步法：是用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物，替代传统方法中的二抗和三抗。这种聚合物拥有强

（一）、仪器设备 1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅 （二）、试剂 1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA・2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂：

一、非特异性染色的识别 常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。 二、非特异性染色的原因 1. Ig与Fc受体结合 多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。 避免方法： ① 用以二抗相同种族的正常血清封闭切片； ② 用不含Fc段的抗体，但价格贵 （V区，C1区不含Fc段，用Pepsin消化） 2．静电吸附 抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。 避免方法： ① 尽量稀释一抗 ② 降低抗体的电荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS； ③ 用去垢剂 如triton-100处理切片。 Tween-20等； 3.二抗与组织中的Ig结合 如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越 明显，如

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、 无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能： 1. 真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。 2. 假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况： （1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。 （2）染色过程中的

（一）、仪器设备 1 ） 18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2 ）水浴锅 （二）、试剂 1 ） PBS 缓冲液（ pH7.2 ～ 7.4 ）： NaCl 137mmol/L ， KCl 2.7mmol/L ， Na2HPO4 4.3mmol/L ， KH2PO4 1.4mmol/L 。 2 ） 0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液（ CB ， pH6.0 ， 1000ml ）：柠檬酸三钠 3g ，柠檬酸 0.4g 。 3 ） 0.5mol/L EDTA 缓冲液（ pH8.0 ）： 700ml 水中溶解 186.1gEDTA・2H2O ，用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0, 加水至 1000ml 。 4 ） 1mol/L 的 TBS 缓冲液（ pH8.0 ）：在 800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1N 的 HCl 调至 pH8.0, 加水至 1000ml 。 5 ）酶消化液： a 、 0.1

免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 ( 荧光素、酶、金属离子、同位素 ) 显色来确定组织细胞内抗原 ( 多肽和蛋白质 ) ，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行 IHC 染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之