细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌 ：细菌在普通倒置显微 镜下为黑色细沙状，根据感染 细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%

植物组织培养（ Plant tissue culture ）技术，是 20 世纪兴起的一项植物细胞工程技术。它的基本内容是：从外界植物体上取下任意的一个到几个细胞或者一块组织在全人工的离体条件下进行培养，经过细胞或者组织的分裂、分化及几何增殖达到植株的形态重建和快速繁殖的目的。 植物细胞具有全能性，即任何一个植物细胞都具有形成该植物体的能力。换言之，任何一个高度分化的细胞都具有回复到原始未分化细胞的能力，并且能分化为其他形式的高分化细胞。 ` 这种 “ 全能性 ” 就是植物组织培养的理论基础。我们依据植物细胞的这种特性，可以任意的使植物体的任何一个高分化的细胞经过脱分化培养（ Dedifferentiation culture ） , 形成原始干细胞团，或者称之为愈伤组织（ Cellus ），将得到的愈伤组织经过一定的的培养途径，这种低分化细胞开始分化，逐步形成各种高分化细胞，这个过程称为植物细胞的再分化（ Redifferentiation ）。再分化后的植物细胞即可形成宏观形态上的芽和

3.2 加温对支原体污染的治疗效果:经观察发现,加温8h后,荧光小点开始变少。16h细胞周围支原体几乎消失。进入24h开始细胞周围的荧光小点完全消失,但细胞开始逐渐变圆。脱落飞48h大部分细胞已完全变圆,细胞正常形态消失,培养基中出现飘浮死亡细胞。　　3.3 多西环素、环丙沙星联合治疗支原体的效果:30μg/ml组和50μg/ml组多西环素和环丙沙星作用细胞24h开始,荧光开始减少,36h仅见少量荧光,48h荧光完全消失。细胞未见明显变形脱落、死亡。100μg/ml组的多西环素和环丙沙星联合作用24h荧光完全消失,至36h细胞无明显变形死亡,但48h开始出现细胞变圆,脱落,生长变慢。　　3.4 BM-Cyclin-1、2排除法:按以上方法处理后,经Hoechst33258荧光染色后,细胞表面及细胞周围干净清晰,无荧光小点。细胞无明显脱落、变形死亡。　　3.5 裸鼠过继法处理细胞后常规培养,经Hoechst33258荧光染色后,未见支原体感染。细胞分裂生长旺盛。　　4 讨论　　支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物,大小一般在0.3~0.5μm之间,呈高度多形性,有球形、杆形、丝状、分

1.固定化动物细胞大规模培养技术 2.动物细胞的灌注养方法 3.动物细胞无血清培养技术 4.动物细胞培养生物反应器前言 动物细胞培养开始于本世纪初1962年,其规模开始扩大,发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。目前,动物细胞有悬浮培养和贴壁培养.技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。 动物细胞的特点及生长特性: 动物细胞虽可像微生物细胞一样,在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养,但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比,有显著差别:①动物细胞比微生物细胞大得多,无细胞壁,机械强度低,对剪

1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每 次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间 污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间 隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可 以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用

一、在细胞生物学方面的应用 通过细胞培养，可使离体组织细胞在体外能以单细胞和细胞群体的形式进行生长繁殖，这不仅有利于在比较简单的容易观察的条件下研究细胞的形态结构和生理功能，而且可以采用特殊的培养方法和观察手段研究不同细胞特有的功能和生命现象，如细胞转化、诱导分化、细胞融合杂交，细胞对不同病毒、不同药物和不同理化因素的敏感性，不同细胞在不同环境中所表现出的不同功能，如细胞因子分泌、吞噬和杀伤效应，这些生命现象和特有的功能均属于细胞的生物学特性，通过对不同细胞生物学特性的研究，我们又可以利用细胞的生物学特性来为医学服务，如利用细胞融合杂交技术，可以制备单克隆抗体来对临床疾病进行特异性诊断和治疗；利用细胞对病毒的敏感性，用于生产病毒疫苗和病毒抗原及抗体，既可用于疾病的预防，又可用于疾病的诊治；利用细胞的诱导分化可使癌细胞向正常细胞逆转，为癌症的彻底根治带来了希望；利用细胞的诱生和促诱生效应，可大量生产细胞因子药物和生化试剂等；利用细胞凋亡又可指导临床对肿瘤的化疗；利用细胞染色体及分区带特性，不仅可采用羊水细

序号 化合物名称 含量 (mg/L) 序号 化合物名称 含量 (mg/L) 1 L-精氨酸盐酸盐

产品描述 DMSO(二甲基亚砜 )属于非质子极性溶剂，常用于化学反应、PCR反应以及在细胞、组织和器官的保存中用作玻璃化低温冷冻防护剂。DMSO用于细胞冷冻培养基内，可以保护细胞免受冰晶引起的机械性损伤。它也可以用于主培养、亚培养、重组异倍体、杂交瘤等系列细胞株，胚胎干细胞（ESC）和造血干细胞的冷冻保藏。另外常常与BSA或FBS混合使用。 用途 （1）DMSO广泛应用在人、动物细胞株及细菌噬菌体λ的低温防护中，制备DMSO溶液用来冷冻细胞的步骤如下： 1)配制冷冻培养基：含有细胞培养用培养基、10-20% 血清和5-10% DMSO； 2)用胰酶或其他合适的方法消化贴壁细胞；（细胞最好处于对数增长期） 3)低速离心（4 °C，250 × g, 10min）收集细胞，吸去培养基； 4)用冷冻培养基悬浮细胞，使细胞密度为106 -107 cells/ml； 5)平

问题1：培养液pH 值变化太快 可能原因 （1）CO2 张力不对 （2）培养瓶盖拧得太紧 （3）NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足 （4）培养液中盐浓度不正确 （5）细菌、酵母或真菌污染 建议解决方法 （1）按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5％ 到10％。 （2）松开瓶盖1/4 圈。 （3）改用不依赖CO2 培养液。加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。 （4）在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。 （5）丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变 可能原因 （1）洗涤剂清洗后残留有磷酸

1.保存血清最好的办法？ 我们建议血清应保存在-5℃至-20℃。若你一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。 2.如何解冻血清才不会使产品质量受损？ 我们建议您将血清从冷冻箱中取出后，先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。 3.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理？ 血清中沉淀物的出现有许多原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性造成的；而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。 若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管中，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。 4.何谓热灭活？

1、RPMI-1640 Medium RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、Minimum Essential Medium（MEM） 也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。 3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。 4、DMEM-低糖（标准型）是一种

常用设备 准备室的设备： 单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。 培养室的设备： 液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。 无菌操作 无菌室的灭菌： 1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射

1. 种类 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml 1.4. 塑料离心管: 15ml, 50ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml, 250ml,500ml,1000ml 2. 清洗和灭菌 2.

维持ES细胞处于未分化状态：ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。 培养基：ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液：DMEM（高糖）、马血清（HS）、L-谷氨酰胺（200mM）、MEM NEAA（10mM）、HEPES（1M）、

细胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。 化学污染 化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。这些污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等。 化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热），所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。 生物污染 生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母的污染，和较难发现的病毒、支原体和其他细胞的污染。 细菌、霉菌和酵母到处存在，它们能在合适的环境中非常快速的生长。这些污染比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养液产生可见的变化，或者通过显微镜观察就可以看见。

1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意

1.如何选用培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。 2.为什么要热灭活血清？ 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？ 它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 4.GlutaMAX-I是什么？ 培养细胞如何利用GlutaM

[精华提要]Wnt配体蛋白在体外含量丰富，但是纯化非常困难。该方法使用Wnt11r蛋白作为一个例子来说明如何使用293T细胞产生分泌Wnt11r和收集Wnt11r蛋白质，在体外作进一步的生化实验。 材料与试剂 1. 293T细胞 2. 胎牛血清（Invitrogen公司，10438-026） 3. DMEM（高糖 货号＃11965，Invitrogen公司） 4. PEN /链球菌（Sigma公司P4333） 5. EDTA的胰蛋白酶（Invitrogen公司15050-065） 6. PBS缓冲液（Invitrogen公司14040-182） 7. Effectene转染试剂（QIAGEN 301425）

1.如何选用培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件： 细胞系 细胞类型 种 组织 推荐使用的培养基 293 成纤维细胞 人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清 3T6 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清 A549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清 A431 上皮型 人 表皮细胞癌 DMEM, 10% 胎牛血清 A9 成纤维细胞 小鼠 结缔组织 DMEM, 10%胎牛血清 AtT-20 上皮细胞 小鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清 BALB/3T3 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM,

1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类