一、PCR技术及步骤 聚合酶链式反应（PCR） PCR扩增产物的克隆 上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。二、PCR常见问题汇总1. 没有得到扩增产物 （1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。 （2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。 （3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。 （4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。 （5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。 （6）使用PCR试剂盒时还应注意： ①是否严格按照说明书操作； ②试剂使用前是否充分混匀； ③试剂储存过久或不当而失效。 2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状 （1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。 （2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。 （3）MgCl2浓度过高。可适当降低

【鸡毛蒜皮】之巧用PCR—重组质粒的快速高通量筛选近几年，随着国内更多的公司掌握了Taq酶的制备技术，市场竞争进入白热化，Taq酶的价格一路猛跌，有的公司甚至推出跳楼价—1毛钱一单位。且不说具体哪个公司的质量好，单单从价格上就已经让人感觉到了类似北京冬天的大白菜和夏天的西红柿的味道。从另外一个方面来看，限制型内切酶的价格却多年不变，我们曾经一度以价格优势占领大片国内市场并把内切酶普及到更多实验室的华美公司近几年渐渐从人们的视线中淡出，而近两年崛起的大连Takara的东西质量不错，在价格上接近了华美，但是毕竟没有出现大幅降价的景象。相比之下，利用PCR筛选重组子的方法的成本已经低于传统的提质粒——酶切法。方法：1）质粒的连接——转化一切如《分子克隆》所描述；2）平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时），我们的工作开始了；3）准备并分装好PCR反应液（除了模板之外的其它PCR反应液的组分），引物最好使用质粒载体上多克隆位点两侧的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；4）用灭菌的牙签（最好是半根，这样节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中

放到“精华”帖子中，以期能进一步深入讨论。请大家积极发言，谈谈自己的体会。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,PCR)是一种利用耐热的DNA聚合酶在体外扩增DNA的方法,为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。当DNA长度小于2kb时，一般PCR反应都问题不大，均较容易得到希望的条带；但当DNA长度较长时，PCR就比较困难了，此时就需对PCR的条件进行优化，以获得期望的条带：1. 模板个人认为，PCR反应中最重要的部分就是模板，模板的种类、丰度、GC含量等都对PCR有很大的影响：1.1 种类一般我用过的PCR模板种类包括由细胞直接提取的基因组DNA，及由细胞提取的总RNA经反转录RT-PCR得到的cDNA。基因组DNA，由于全部基因组全在其中，比较大，其形成二级结构的可能性就比较大，引物在退火时就比较困难,可以试试用酶切的方法解决：选择1-2种目的片段上没有的酶将基因组切碎，可能有助于打开二级结构。用总RNA再RT-PCR

EvaGreen qPCR 荧光染料一种被广泛用于实时定量 PCR 的绿色荧光 DNA 染料 EvaGreen®是一种用于实时定量 PCR（qPCR）的 DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于 SYBR Green I。除了有相似的光谱特性，EvaGreen 有三个主要特点使它区别于 SYBR Green I。首先，EvaGreen 对 PCR 的抑制性远小于 SYBR Green I。因此，使用EvaGreen 进行的 qPCR 实验可以使用快速 PCR 步骤。同时，EvaGreen 在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于 SYBRGreen I 扩增信号（图 1 ）。较高浓度的 EvaGreen 也消除了“染料重分布”的缺陷，使 EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（ HRM ）（图 2）。该分析正被越来越多的用于 PCR 后的基因分型和异源双链分析 。由于 SYBR Green I对 PCR 的抑制性，从而要求其使用浓度必须很低，因此 SYBR GreenI 无法解决由低浓度造成的染料重分布问题，既不能用于多重 PCR 也

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼

选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：(1 ）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640 。(4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 细胞系 细胞类型 种 组 织 培养基 293 成纤维细胞 人 胚胎肾

　　赛默飞世尔科技（中国）有限公司于2010年10月26-27日在重庆医科大学及第三军医大学举办了细胞培养与常见问题解决&移液器维修交流会，吸引了众多在校师生前来参与，整个活动在热烈的气氛下进行，并获得圆满成功。 　　会上，赛默飞世尔全球产品技术专家Raymond Mercier博士介绍了先进的Thermo Scienditic 2D储存追踪系统。随后，实验室产品部的技术专家向同学们细致深入地阐述了细胞培养与常见问题解决方案，并就“细胞培养的技巧和产品选择”的话题与师生们展开了热烈的探讨。此外，赛默飞世尔科技的技术专家们还向与会人员介绍了细胞实验室的自动化系统等先进实验设备。与会专家不仅用精彩的讲座让同学们对细胞培养技术和相关设备有了更深入的了解，更积极地为各位同学解惑答疑，为他们的学习和科研提供了大量有价值的信息和技术参考。 　　在举办交流会的同时，产品专家们也向广大同学介绍了Thermo Scientific产品，实验室自动化系统等先进的实验设备成为本次交流会最受瞩目的产品，尤其是Thermo Scientific 2D储存追踪系统。当介绍到其高密度的编码

一、准备工作对开展细胞培养异常重要，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等。 1.清洁、消毒、液体 直接接触细胞的用品要超净处理——无非必须分子 直接接触细胞的用品要彻底消除微生物 超净和消毒过的样品要绝对密闭保存，标记消毒时间 实验室保持洁净，随时消毒 尽量采用商品化一次性用品 操作者也要清洁和消毒 缓冲液要符合生理渗透压（280～310 mOsm）和pH（7.2～ 7.4 ） 2.玻璃器皿超净 去污剂煮沸30min（超声波震荡30min） 温水刷洗 流水冲洗 酸性洗涤液浸泡 流水冲洗 蒸馏水冲洗 纯水漂洗 在洁净温箱中烤干 密封消毒 3.消毒 干热——玻璃器皿 160℃，120min 湿热（高压，120 ℃ ） 10~20磅，20~30min 紫外线——空气 消毒剂——场面 微孔过滤——液体 0.22um、0.45um 二、细胞生长的条件和培养基要求：选择合适

1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每 次操作只处理一株细胞 株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞 间 污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间 隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞 株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可 以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是

(一)原理 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。 常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。 (二)操作 1．将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。 2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即

1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。 2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。 排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。 3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率 根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。

细胞培养方法 Invitrogen life technologies 细胞培养液 Invitrogen life technologies 培养液检索 ATCC 用的数千种不同培养液 参考表：特殊细胞需要的生长因子 Invitrogen life technologies 组织培养方法 Bradley Lab at Baylor College of Medicine 基础细胞培养方法 QIAGEN 国家细胞培养中心 由美国国家研究资源中心和国立卫生研究院联合建立，主要提供细胞培养方面的服务 低密度的胶原酶消化的脾细胞的准备 外周淋巴细胞收集 从外周血中收集淋巴细胞 收集小鼠成骨细胞 提取小鼠成骨细胞 淋巴细胞收集 从小鼠的肝脏收集淋巴细胞 腹腔细胞收集 收集小鼠腹腔 细胞保存方法 详细介绍保存细胞系的方法 细

1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常 ( 例如产生单株抗体或是其它蛋白质 ) 。 3. 材料 3.1 37 oC 恒温水槽 3.2 新鲜培养基 3.3 无菌吸管 / 离心管 / 培养瓶 3.4 液氮或干冰容器 4. 步骤： 4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 4.3 将新鲜培养基置于 37 °C 水槽中回温，回温后喷以 70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 4.4 取出冷冻管，立即放入 37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，以 70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 4.5 取出 0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内 ( 稀释比例为 1:10 ～ 1:15) ，混合均匀

一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。 由组织并分

(一)原理 细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。 (二)操作 1．取材 用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。 2．切割 用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3 左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 3．消化、接种培养

1. 血清必须贮存于–20 ～ -70 oC，若存放于4 oC，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20 oC 直接至37 oC 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多

前段时间，经历了几个月的时间，为实验室建了一个细胞培养间。目前这个细胞培养间运转良好，培养的神经元长了 10 来天，长势不错，已经可以认为细胞培养室建立成功。在建立细胞培养间的过程中，碰到了许多问题，逐一解决后，觉得大家如果要建立细胞培养间，肯定也会碰到许多相同的问题，所以将我碰到的问题整理出来。首先向大家推荐一本书，个人认为是比较经典的——《动物细胞培养 - 基本技术指南》科学出版社，英， R.I. 弗雷谢尼。内容不多，但以下的资料大部分是书上找不到的。 2005-4-30 陆新江一、建细胞间的一些细节问题 1 、甲醛薰蒸：资料（ internet ）：40 ％甲醛溶液 ( 药用规格、福建三明化工总厂出品 ) ，用量 30 ml ／ m3 ，室内温度 21 ～ 24 ℃ ，相对湿度 75 ％～ 85 ％，加热薰蒸使蒸汽弥漫全室，关闭门窗 1 h 。甲醛水溶液为无色，具有强烈刺激性气味的液体，可杀灭多数微生物，价廉，熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含 37 － 40% 的甲醛。其主要用法为： （1）熏蒸消毒 : 对室内

实验原理 人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。 1912年，Warfter 最先研究人类染色体。1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。 细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于： （1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用 ：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞

1 科学研究:药物研究开发与基础研究 药物研究与开发 (1) 新药筛选:如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等. (2) 疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等. (3) 基因工程药物研究与开发:如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等. (4) 细胞工程药物研究与开发:生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发. (5) 单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体. 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 2 生物制药 (1) 疫苗生产:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等. (2) 基因工程药物生产:如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等

实验原理 传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。 这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 实验试剂 L磷酸盐缓冲液(PBS) 无钙、镁溶液 细胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTA EMEM液 3%谷氨酰胺 0.5％台盘蓝染液等 实验设备 解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤