http://www.ebiotrade.com/bbsf/xjszl/B20027816518.asp 优化基因表达的关键因素之：基因的重新设计和合成 密码子最佳化（codon optimization） 遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，Pichia，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用[1]。有趣的是，灵长类和酵母有6个同样的利用率低的密码子。大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）的事实并不很奇怪。你的基因利用的密码子可能不是你正在利用的蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子，这种情况是可能的。利用偏爱密码子(pref

　　一旦生物样品被收集采摘，它的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解，或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析（Array Analysis）、定量RT-PCR等实验来说，采 样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。为了达到这个目的，往往需要将液氮或者干冰带到采样现场，采样后立即运回实验室保存。对于实验者来说，无论是采样还是将样品取出以抽提RNA都非常不方便。QIAGEN公司最新推出的RNeasy Protect Kits提供一种RNAlater RNA Stabilization Reagent，只要在采样后立即加入这种试剂，即可保护样品中的RNA完整而不被降解。在RNAlater中的样品RNA可以在37度下稳定保存1天，或者在18—25度保存7天，2—8度稳定4周，或者在-20度永久保存。这种技术为在不同温度下采样，运输和保存样品提供了极大的方便，特别适用于各种动物组织、培养细胞、细菌、白细胞，但必须说明的是它不适用于全血或体液中RNA的保存。 　　R

2，3－DPG：2，3－diphosphatidylglyceric acid，2，3－二磷酸甘油酸 2－CdA：2-chlorodeoxyadenosin,cladribine，2－氯去氧腺苷 3H－TdR：tritiated thymide，氚标记胸腺嘧啶核苷 5－Aza：5-azacytidine，5－氮（杂）胞苷 a2-PI：a2-antiplasmin, a2－纤溶酶原抑制物 AA：aplastic anemia，再生障碍性贫血 AAV：adeno-associated virus，腺病毒相关病毒 ABC：avidin-biiotin complex method， 亲和素生物素复合物法 ABMT：autologous bone marrow transplant，自体骨髓移植 Ac：accessory cell，辅佐细胞 ACD：acid citrate dextrose，酸性枸橼酸盐葡萄糖 ACP：acid phosphatase，酸性磷酸梅 ACTD：actinomycin D，放线菌素D ACV：cyclovir，阿昔洛韦 AD：antigen determinant

1．溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2．NaOH－SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须

芯片实验设计要点 作为一种高通量的实验平台，基因芯片可以同时对多至上万个基因进行表达水平的监测。考虑到芯片实验本身的高成本，实验前对整个实验方案的认真设计就显得非常重要。影响芯片结果的主要方面包括被检测实验材料本身，芯片实验过程，数据处理过程。 实验材料 实验材料的选用直接影响到最后结果的解释。在选择时要注意以下几点： 1.根据实验需要达到的目的，首先要求实验材料具有代表性，如临床标本的取材部位，病人的临床诊断是否明确，同时要考虑疾病本身的多样性背景等等； 2.其次根据材料的特性选择合适的实验路线，如材料来源的难易，材料的类型（细胞或组织或其它生物类型），对于来源较困难的样品，需要对其进行适当的处理（如体外扩增）；而对于来源充足的样品，则可以直接用于芯片实验而避免体外处理带来的系统性误差； 3.最后是取材过程的控制，基本要求是快速准确，同时注意样品保存条件的合理性。 芯片实验过程 1.首先是芯片实验的重复性要求 一般情况下芯片实验要求有独立的重复性实验以减少假阳性或假阴性结果的产生，但是考虑到实验的成本，也有研究人员采用一次芯片实验的结果作为参照通过其他低成本的方法如RT-PCR，

活体电穿孔法介绍 1、什么是活体电穿孔 活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞 。近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。 活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。 2、活体电穿孔的法的特点 活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面: 首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。 在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌

我做质粒小量提取,刚开始的几次实验都没有理想的结果,分析来分析去发现问题可能是培养时间的问题:将菌种从-70度接到LB培养基37度过夜,再用此菌液涂平板获得单克隆,用EP管取1.5毫升LB培养基,用接种环每挑一个菌落每接种一管(将挑到的菌落全洗下去),37度培养约13个小时,直接按照"分子克隆"提供的碱裂法提,结果一无所获. 后来在师兄的提醒下我想到是否是因为培养时间过长而使质粒缺失? 于是我测了此菌的大致生长曲线,发现其在37度约12小时达到稳定期,于是我从培养平板上挑单克隆于100毫升LB培养12小时(37度),接着以2毫升此菌液于50毫升LB接种摇瓶,在培养时间为10,11,12小时时分别做了抽提,结果得到的条带很好. 由此我总结,在做质粒抽提时一定要首先搞清楚要抽提对象的生长周期,一般细菌在对数生长期做抽提最好. 不知道各位大侠以为?你们的一些经验可以拿来大家分享一下吗?先谢谢各位了!!! 附实验方法: 质粒DNA的小量提取 （碱法）： 一．试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。 1M Tris

1．目的 学会用限制性内切酶切割质粒DNA。 2．原理 II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。 3．器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。 4．试剂 Pinpoint™xa-3质粒，EcoR V，BamH I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液，荧光染料。 5．实验准备 配制TAE电泳缓冲液（50´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。 6．操作步骤 （1)混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中： Pinpoint™xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl 10×酶切缓冲液（用EcoRV的缓冲液） 2 μl ddH2O 30 μl EcoRV 1μl BamHI 1μl 总体积 40μl （2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。 （3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离

一，酵母表达系统 毕赤酵母表达系统（invitrogen公司）：分泌型质粒pPIC9K， 宿主菌毕赤酵母GS115 分泌型质粒pPICZalpha （甲醇诱导）宿主菌毕赤酵母x33 分泌型质粒pHIL-S1 二，原核表达质粒 表达宿主菌为BL21(DE3)系列 带His标签（N端）：PET5-(a)氨苄抗性 带His标签（N端）：PET28-(a)卡那抗性 带His标签（C端）：PET24-(b)卡那抗性 带His标签（C端）：PET21-(a)氨苄抗性 带His标签（N端）+TrxA(硫氧还蛋白)：PET-32a氨苄抗性 带His标签（N端）+DsbA(二硫键形成蛋白A)：氨苄抗性 带Gst标签（N端）：pGEX-KG，pGEX4T-1，pGEX-5x-1 共表达载体：pET-duet。(含有两个T7启动子) 表达宿主菌为M15系列 表达载体：pQE31 表达宿主菌为DH5a,JM109系列 热启动表达载体：pBV220 克隆载体 pGEM-7Z,pUC19 三，自研发原核表达载体 1，带His标签（N端）：PET-DsbA卡那抗性 2，

原始出处： 商业周刊 b20191c 生物科学倍受关注，生物技术股票上扬。生物技术业还需作何承诺？ 基因技术公司（Genetech）治疗结肠癌的药物“Avastin”不是一夜之间研制成功的。13年前，公司的一位科学家发现了一种可以控制向肿瘤供血的基因，并开始研究如何杀死这种基因。公司用了5年的时间研制出一种抗体，通过对老鼠的试验，发现这种抗体可以在老鼠身上起到一个类似开关的作用，同时又开发了另外3种抗体，使之形成药物。然后，该公司又进行了动物试验、安全性试验和大规模人体试验，来确定该药物的疗效。而华尔街则根据每一份试验情况报告的好坏做出相应的反应，于是乎公司的股票时而被大笔抢购，时而又被大量抛售。 目前上演的是它的股票被抢购的一幕。5月19日，基因技术公司宣布，患者在接受“Avastin”化疗后可以延长生命。这一消息唤起了人们对这种药物的希望，它将成为新一族可以切断对肿瘤供血的药物中的首例。据新闻报道，投资者把基因技术公司的股价抬高了45%，达到55美元。试验尚未结束，产品能否得到政府批准还是个未知数，但基因技术公司很乐观。公司的首席医学官苏姗·德斯蒙德-赫尔曼博士说：“我们正在探

siRNA的设计要点 一、体外合成siRNA的设计: 如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题.基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。以下所述几条对于siRNA设计的成功极为重要。 1. 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3''端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA重复)来设计。 2.避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。 3.SiRNA序列的GC含量应为30%-50%左右。 4. Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5''和3''端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 5. 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。 6.将潜在的序列和相应的基因组数据库

【xx】既然是摘抄的就共享吧，不要原创了。谢谢！ 我发现比较好得超星书籍，但是无法复制和拷贝，只有自己写了，我摘抄了一些大家平时关注得问题，谢谢支持！ 从组织培养细胞中同时分离DNA和RNA 1. PBS:0.137MOL/L NACL,2.68mmol/l KCL,7.98mmol/l NA2HPO4,1.47mmol/l KH2PO4,PH7.2 2. 二乙其焦炭酸盐（DEPC）处理水，1mlDEPC加入到1L得重蒸水中（0.1%DEPCv/v）后搅拌过夜。20psi(1psi=6.8undefined10(3)PA),高压灭菌20min可以使得DEPC失活 3. STEL缓冲液：0.2%SDS,10mmol/l tris-hcl,PH7.5,10mmol/l EDTA,100mmol/l LiCl,在DEPC处理过得水中加入TRIS-CL,EDTA和LIcl,高压灭菌后加入适量得10％得SDS，10gSDS溶于DEPC处理得水中配置成10％SDS贮存液，使用前65度保温2h. 4. 酚;酚得平衡如前所，先用PH8.0得0.5mol/l Tris-hcl抽提含有，1％8－羟基喹琳得超纯

DNA测序技术上的快速发展，加快了我们对不同物种和生物体的基因组序列和结构的研究步伐。在已有GS 20的技术基础上，罗氏诊断公司和454公司不断加大创新投入，又于2007年推出了通量更大，读长更长，准确性更高的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System (GS FLX)，相信它的出现，必将掀起测序技术的进一步革命；对整个基因组学的研究将产生巨大的推动作用。GS FLX是世界上第一个可以提供超高通量基因组和长片段DNA测序的商业化系统设备，只需要一步简单的全基因组样品制备过程，就可以在7.5小时内获得超过1亿个碱基信息。避免了目前技术中的大规模自动化技术的使用；单个人工就可以在几天内而不是几个月的时间里完成样品的准备，序列测定和结果生成整个过程。通过建立在PicoTiterPlate上的大量平行测序，采用最先进的图像处理技术和独特的数据分析可以获取高质量的结果。 1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。 2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成

来源：生物通 儿童交替性偏瘫AHC是一种罕见的严重的神经发育综合症，症状是周期性的偏瘫发作，在发作时患者身体一侧瘫痪，而后又会换成另一侧瘫痪，其发病间隔无法预测。这一疾病的患者通常还伴随有癫痫、学习障碍和行踪困难等症状。 Duke大学医学中心的研究人员通过外显子测序发现，大多数AHC患者的疾病是由于一个基因上的突变引起的，并由此给治愈这一疾病带来了新希望。该研究发表在7月29日的Nature Genetics杂志上。 AHC通常是一种散发性的疾病，这意味着通常患者家族中其他人并没有这种疾病，至今人们还不了解其病因。“因此，我们寻找的基因突变在患病儿童体内存在，而在其父母体内并不存在，我们仔细的比对了7组AHC患病儿童及其健康父母的基因组。当我们在这些患病儿童体内找到了同样的基因新突变时，我们知道这就是这一疾病的病因。”该文章的共同作者医学助理教授Erin Heinzen博士说。 研究人员对7组AHC患病儿童及其健康父母的基因组进行了外显子测序，发现位于ATP1A3基因上的de novo非同义突变就是AHC的病因。ATP1A3属于关键性的转运分子，这一转运分子通过在神经元（神经细

RNAi，RNA interference，RNA干扰，是被认为最有前途的一种实验方法。 下面是简介，然后是资源汇集。 1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。 直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的

最近在做质粒提取方面的实验，搜集了相关资料与大家分享，这是传统提质粒的方法，与试剂盒提质粒不同，通过这个过程大家可以更好的明白实验原理。 1．目的 学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。 2．原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。 3．器材 超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌器等。 4．试剂 Pinpoint™xa-3质粒载体菌，pBS-CHI载体菌，LB培养基1000ml（含100µg/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4

最近看了一篇关于碱法抽提质粒的文章，觉得很好，特拿出来和各位分享。 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技 术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生 却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实 验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后 来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这 个状态。这就不得不让人感到悲哀了。 我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人 心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义 就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的 根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它 只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有 那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思

李再新 张富春 （新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 乌鲁木齐 830046） 自Wolff等1990年发现DNA能够刺激机体产生免疫效应以来,在全世界范围内迅速掀起了一股DNA疫苗研究热。在近十年的时间里,科学工作者在鼠、鸡、猪、牛、猫、猴和黑猩猩等动物中进行了广泛深入的抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、抗肿瘤及免疫不育的DNA疫苗研究。由于DNA疫苗能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,并兼有减毒活疫苗的有效性和亚单位疫苗的安全性, 而且制作简单、经济、易于储存运输等优点已在免疫学领域引起一场重大的革命。近年的研究还表明, 虽然DNA疫苗具有广泛的优越性,但在免疫效力上却还不及活疫苗有效,尚未达到人们的期望值。如何提高DNA疫苗的免疫效应成为研究者关注的热点,本文就利用DNA分子佐剂增强DNA疫苗效果的研究讨论如下: 1 改善免疫途径和免疫方式 不同免疫途径和免疫方式可对抗原DNA的吸收、表达和提呈产生影响,因而诱导出不同的免疫反应强度。目前，普遍采用直接注射器注射法和基因枪注射法,将DNA疫苗导入到机体内。免疫部位常选在骨骼肌、表皮、粘膜和静脉等组织器官。虽然肌肉组织的抗

《生物化学》清华大学出版社！ 第一章 1,氨基酸（amino acid）：是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连在α-碳上。 2，必需氨基酸（essential amino acid）：指人（或其它脊椎动物）（赖氨酸，苏氨酸等）自己不能合成，需要从食物中获得的氨基酸。 3，非必需氨基酸（nonessential amino acid）：指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成 不需要从食物中获得的氨基酸。 4，等电点（pI,isoelectric point）：使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的静电荷为零）的pH值。 5，茚三酮反应（ninhydrin reaction）：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应。 6，肽键（peptide bond）:一个氨基酸的羧基与另一个的氨基的氨基缩合，除去一分子水形成的酰氨键。 7，肽（peptide）:两个或两个以上氨基通过肽键共价连接形成的聚合物。 8，蛋白质一级结构（primary structure）：指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。 9，层析（chr

生物芯片技术的发展和展望（一）http://www.bioon.com/Article/Class24/Class18/200407/9773.html 作者：令狐 文章来源：中国生命科学论坛 点击数： 更新时间：2004-7-22 不得不承认，生命科学目前还处于技术而非理论推动发展的阶段，一次大的技术革命就会带来一次生命科学的大飞跃。上世纪七十年代的克隆、测序技术推动了人类对基因的初步认识，八十年代出现的PCR及其无数的派生技术则极大的丰富了人类对基因的细节知识。九十年代以来，生命科学有发展而无飞跃，这是为什么！哈哈，因为它在等待下一次技术革命的到来，那就是生物芯片技术。 一、乱谈biochip和microarray 就像大部分生物学术语一样，生物芯片（biochip）的内涵也一直随着时代而与时俱进。Biochip最早出自目前意义上的microarray（微阵列），也就是国内各位最熟知的、二维的、有规律的高密度固定生物分子的实验技术，不过近年以来biochip的涵盖的范围已经很大的变化了。虽然国内至今还有例如“用生物芯片研究。。。。”的文章不断出现，但是大家可以注意到，“生物芯片