mylab大师你好： 小人有几个问题想求助，非常着急，希望你能出手。本人刚开始做southern和northern，出现了几个棘手的问题无法解决，希望你能帮助，感谢！ 第一张图是Northern杂交，最右边的是Marker（出现了一些非特异结合，很正常）剩下的都是总RNA的杂交条带，孔的浓度是一个梯度，大体都在10ug左右，不知为什么这么淡，是不是有RNA降解的可能？或者是我的杂交液中的探针浓度不够（我用的浓度一定比说明书上的高）？显色时间比较长所以背景比较深。我用的试剂盒是Roche的DIG Northern Starter Kit，没有用他的显色底物，而是用的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I中的NBT/BCIP底物，因为我没有显影液和定影液，所以没有用CDP-Star。还有为什么在边缘的条带跑的快，是不是MOPS电泳缓冲液的原因，我在整个电泳过程中没有换过缓冲液，电泳大约2个小时左右，没40分钟停止电泳，拿出胶后搅一搅缓冲液。 第二张图是Southern杂交，用的是DIG High Prime DNA L

主题： 染色质结构与基因表达调控 胡建广　杨金水 Chromatin Structure and Gene Expression HU Jian-Guang　YANG Jin-Shui (Institute of Genetics,　Fudan University,　Shanghai　200433) 　　真核细胞中DNA与蛋白质结合形成染色质和染色体是生物进化的必然结果〔1〕。 　　核小体(Nucleosome)是染色质的基本结构单位，其为长度约160bp的DNA绕由H2A, H2B, H3和H4各两分子形成的八聚体约两圈的粒状结构, 其中H3和H4各两分子形成的四聚体位于八聚体的中间, 其两端均与H2A和H2B各一分子形成的二聚体结合。第五种组蛋白H1或称H5与连接两核小体之间的DNA结合, 并与相邻两核小体首尾相联, 以稳定核心组蛋白与DNA双链的结合。Crane等(1997)对H1与核小体的结合位置提出新的看法〔2〕, 认为染色质的高级结构是以核小体为基本结构单位的一级结构经过进一步的盘绕、折叠而形成。由于染色质是真核细胞遗传信息的载体, 真核基因的表达调控一定与染色

RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA干扰（RNA interference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表发现了一个新层次上的基因表达调控方式。生物通早在去年底到今年初已经有很多文章介绍有关siRNAs以及其在RNA干扰中的作用以及研究应用方法，在这里生物通继续为我们的用户介绍另一种越来越引人注目的小分子RNA——microRNA。 什么是miRNA MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（m

感谢参与！给出链接即可！如果可能，楼主可以给一个comment。0 引言 在功能基因组学(functional genomics)研究中，阐明各种蛋白的结构和生物学功能是其核心任务，不仅是生物学的主要研究方向，而且也是医学研究的主要内容，毕竟细胞的功能和表型是由细胞中的蛋白来主导的，许多疾病都是蛋白结构与功能、表达水平与调节的异常引起的. 研究蛋白的功能，常常通过改变蛋白的表达水平，观察细胞的生物学特性的变化，来研究蛋白相应的生物学功能. 这种研究策略包括强制性地升高特定蛋白的表达水平，也包括蛋白表达水平的缺失. 研究表明，在功能基因组研究中，功能缺失(loss of function，LOF)策略具有特殊重要地位. 1 反义寡脱氧核糖核苷酸和反义RNA 反义分子包括反义寡脱氧核糖核苷酸 (oligodeoxynucl-eotide，ODN)和反义RNA(antisense RNA)等. 反义技术(antisense technique)是指反义DNA/反义RNA分子作用及其机制研究的技术. 他是通过以碱基互补配对方式结合，抑制、封闭或破坏目的基因结构及其表达的核酸分子，利用反义

质粒DNA的大量提取和纯化 　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 （一）、碱法 　　1、取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液400ml，4℃下5000转离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 2、称重一般为3-4g. 　　2、将细菌沉淀物重新悬浮于4ml/1g溶液I中,充分悬浮菌体细胞。(该步骤很重要，悬浮不充分直接影响到细菌的裂解效果，可用研棒研磨，振荡器充分震荡。然后移入80ml离心管中。) 　　5、加入8ml/1g新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴3分钟。(时间不能太长，震荡不能太剧烈，否则基因组DNA会断裂) 　　6、加6ml/1g用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置10分钟,此时应形成白色絮状沉淀。 　　7、4℃下12000转离心30分钟。（应该重复1---2次，直到溶液澄清，过滤无杂质。这步是成功的关键） 　　8、加等体积异丙醇,室温静置10分钟, 4℃下12

暗室实验暗室实验的操作流程：1. 新鲜配制1-2ml工作液（A液与B液1:1或1:40混合配制）2. 进入暗室，在黑暗的条件下，加入1μl未稀释的二抗（HRP连接物）3. 混合后，可立即在暗室中观察到蓝色光暗室实验的注意事项：? 工作液按正确比例混合，且新鲜配制? 在暗室中加入二抗? 直接使用未稀释的二抗? 加入二抗后，立即观察注：暗室实验可同时检测底物是否有活性，以及二抗是否有活性。如果暗室实验结果阴性：更换其它二抗，再次进行检测；再次检测结果仍为阴性，证明底物丧失活性。暗室实验结果阳性：认为二抗及底物活性良好； Western Blot 系统需要进一步优化优化抗原和抗体浓度的斑点杂交方法：斑 点 杂 交 方 法——优 化 抗 原 和 抗 体 浓 度对于一个给定的抗原，最佳的抗体浓度依赖的抗原和抗体本身。抗原和抗体的亲和力，以及一抗与二抗的特异反应都是不同的。最优抗原和抗体浓度可通过免疫印迹实验中使用不同浓度的抗原和抗体作用确定。另外，更快和更简单的方法是进行斑点印迹实验。以下是使用超敏感信号底物进行的斑点印迹的操作方法。注：所有的抗体稀释度假定起始浓度为1 mg/mL。1. 用TB

真核细胞DNA的制备与定量 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 一、试剂准备 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。 3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。 4．20% S

在分子生物学领域里摸爬滚打了两年多，在园子里也逛了一年多，没写过什么原创贴子，这算是第一个，只是浅显的经验，希望与大家交流、分享、共勉！！！ 我看到了很多帖子，大家在查找Gene序列的时候，有些战友总是弄不明白那个是自己想要的序列，因为在NCBI的GeneBank里面搜索以后，实在是有太多的序列出现，而且长短不一，名称各异，DNA，mRNA ……，有点让人眼花缭乱，下面就是我的一点小经验： 通常大家都是在Nucleotide里搜索一个目的Gene序列，也就是我们通常所说的GeneBank，GenBank是一个公共可获得的序列记录备份，由数据发现者提供，它不是一个校正的数据库，GenBank是一个序列的存储池，所以针对同一个Gene就会有很多的信息，甚至有些似乎是重复的，这包括了一个Gene的发现，当然就包括不同的发现者有不同的命名规则；起始时期的序列不完整性；研究发展历史；不同的型别研究等等。当我们搜索时，就会象大海捞针一样找我们的目的Gene，在这里我就告诉大家另外的搜索链接，那就是Gene数据库。 在下图中，标示了它在NCBI中的位置，其实很多人都看到过它，但是可能没用过它，

Transheep小编发现GraphPad Prism不仅简单易学而且可以搞定大部分医学研究所需的统计与作图，所以今天总结了几种常用统计图的做法，教您轻松快速地做出漂亮的统计图，您只需花很少的时间看完这个教程就可以彻底摆脱excel笨拙的作图功能了。废话不多说让我们正式开始。 1. 折线图 折线图最为统计图中很常见的一类图，它的特点是可以显示随时间而变化的连续数据，因此每个数据点都有一个相应的X轴值和Y轴值，所以我们在用graphpad做折线图时在数据表类型的选择上一般选XY图（XY graphs）。如下文实例。 1.1 根据Table1的1组原始数据（4个样本在4个时间点分别测得的OA值）做折线图 Time (days) OA 0. 0.942 0.846 0.691 0.515 4. 0.717 0.836 0.653 0.483

Solexa 高通量测序法原理 Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100 － 200bp 大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。随后在含有接头的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ）的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定

核酸分析软件下载 软件名称　 AnnHyb2.22 软件大小 207k 立即下载 AnnHyb2.22是设计PCR引物和DNA探针的辅助软件。主要功能有： 1.对寡核苷酸序列，计算溶解温度(nearest-neighbour algorithm，可以设定盐浓度和引物浓度), 序列长度、GC百分比,分子量, 摩尔消光系数,IUB/IUPAC序列、反向序列、互补序列。 2.对50个bp以上的序列, 计算长度,GC百分比、不同盐浓度下的溶解温度 3.对长序列可以进行反向互补序列。 4.可以读出序列 http://biochemsoft.biosino.org/swdl/low/annhyb222.zip 软件名称 DNASIS 2.5 软件大小 5319k 立即下载 综合性低级结构分析软件，包括DNA、RNA、蛋白质，与DOS下的PCGENE、windows下的Omiga属同一类的软件。 http://www.medprobe.com/img/wdnasis.pdf422k教学文件 http://www.medprobe.com/img/dnadmo25.zip 软件名称　 DNAs

原文见： http://www.ebiotrade.com/newsf/2003-12/B20031219174450.htm RNA一度被认 为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA干扰（RNA interference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表发现了一个新层次上的基因表达调控方式。生物通早在去年底到今年初已经有很多文章介绍有关siRNAs以及其在RNA干扰中的作用（参见综述：RNAi回顾）以及研究应用方法，在这里生物通继续为我们的用户介绍另一种越来越引人注目的小分子RNA——microRNA。 什么是miRNA MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发

诺贝尔奖得主最新发表新方法 来自斯坦福大学医学院病理学和遗传学系，约翰霍普金斯医学院生物学系，以及华盛顿Carnegie学院（Carnegie Institution of Washington）等处的研究人员发展了一种能帮助观测体内细胞质中蛋白和蛋白相互作用的分析方法：differential cytolocalization assay（DCLA），这一方法已证实可以检测线虫RNA干扰和无意义介导衰变(nonsense-mediated decay，NMD) 途径过程中蛋白的相互作用。这一研究成果公布在《分子细胞蛋白质组学》（Molecular & Cellular Proteomics，MCP）杂志上。 这一文章由2006年诺贝尔奖医学/生理学奖获得者之一Andrew Z. Fire领导完成。 1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello证实，之前康奈尔大学Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们

主要试剂及溶液的配制 细菌培养基: 1)LB液体培养基: 胰蛋白胨 10克 酵母提取物 5克 氯化钠 10克 以950ml去离子水溶解，用5M的NaOH 调pH值至7.0(约0.2ml)，最后以去离子水定容至1L。高压灭菌15磅 20分钟，4℃保存。 2)LB固体选择性培养基: LB液体培养基 1L 琼脂 15g 高压灭菌后，室温放置，待液体温度约50℃时， 加入50mg/ml的氨苄青霉素1ml，使氨苄青霉素的终浓度为50ug/ml。将培养基混匀后在超净台内分别倒入预先灭菌好的10cm2平皿铺板，培养基层2－3mm，待冷却凝固后，密封倒置于4℃保存备用。 碱裂解法提取质粒所用液体 1)溶液I: 溶菌酶 4mg 去离子水 1.4ml 500mM葡萄糖 0.2ml 100mMEDTA 0.2ml 250mMTris-HCl (pH=8.0) 0.2ml 2)溶液II: 去离子水 2.4ml 10%SDS 0.3ml 2MNaOH 0.3ml 3)溶液III: 乙酸钾 29.25g 冰醋酸 11.5ml 加去离子水至100ml 4

大肠杆菌的基因型 甲基化相关的基因型 dam (DNA adenine methylase) Map position: 74 min 功能：dam基因表达DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特异序列GATC中A的甲基化，保证DNA免受限制性核酸内切酶Mbo I的切断，同时在DNA复制时也起一定的辅助作用。dam基因的变异导致腺嘌呤（A）甲基化酶活性的缺失，使腺嘌呤 (A) 不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。 dcm (DNA cytosine methylase) Map position: 43 min 功能：dcm基因表达胞嘧啶甲基化酶，它能特异性识别DNA双链上的CCWGG序列，并使第二个C甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相关限制酶的切断。dcm基因的变异导致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于获得非甲基化质粒。 mcrA (Modified cytosine restriction protein a) Map position: 26 min 功能：mcrA基因表达大肠杆菌防御体系中起重要作用的mcrA酶，这种酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的

曾建议成立翻译共同体的，得一些战友支持，选此书练笔，一度中止，偶会继续努力！ 绒毛组织培养 样本准备：20ml注射器，含6ml无血清RPMI1640及两滴500IU/ml的肝素 将绒毛组织吸入注射器内，再注入皮氏培养皿后，送至实验室处理 1。倒置显微镜下观察，用细镊子将绒毛组织与蜕膜仔细分离，可用HBSS液清洗，将样本分成两等份，一份用于直接法，一份用于培养。 2。直接法： 将皮氏盘内的培养液换成3ml 37 C 预热20%灭活的胎牛血清，1%庆大霉素，放置于5%CO2，100%湿度的培养箱 3。同步化 培养3小时后，加入0.1ml10-5MFUdR 液 孵育15小时 加入0.1ml10-3MThymidine,继续培养5小时 加入0.1秋水仙素至终浓度为10ug/ml，孵育1小时 4。收获细胞 移出培养箱，巴斯德吸管轻轻吸去培养液 慢慢加入3ml1%柠檬酸钠（预热37C），37C孵育20分钟 缓缓加入0.5ml固定液，中止低渗作用 吸去低渗/固定液，边摇边滴加新鲜固定液2ml(甲醇：乙酸，3：1），清洗绒毛组织，吸去固定液，再加入新鲜固定液2ml 冰箱过夜，或20分钟（24小时出结果

1 引言 1.1 分子标记概念的界定 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。 1.2 理想的分子标记的界定 理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。 但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。 2 分子标记的种类 2.1 限制性片段长度多态性 2.1.1 限制性片段长度多态性(restriction fr

1.1 核酸序列的检索 http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide 1.2 核酸序列的同源性分析 1.2.1 基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi 1.2.2 核酸序列的两两比较 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 1.2.3 核酸序列的批量联网同源性分析(方案) 1.3 核酸序列的电子延伸 1.3.1 利用UniGene数据库进行电子延伸(方案) 1.3.2 利用Tigem的EST Machine进行电子延伸 EST Extractor: http://gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html EST Assembly: http://www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 利用THC数据库对核酸序列进行电子延伸 http://gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲

坑爹啊，一个载体构建，花了我四个月时间，往事不堪回首，为了各位兄弟姐妹们避免重蹈我的覆辙，我就一把鼻涕一把泪的给大家倾诉一下。 构建之前啊，我就翻丁香园啊，把里面关于载体构建的精华看了一遍啊，然后呢，以为构建载体很简单啊，以为一个月能搞定啊，所以满心欢喜的就开工了啊。 实验室没有载体，就跟别人借。载体借到了，按照文献里报道的选了两个酶切位点，离的太近，先单酶切验证，一切正常。接着往地下做，为了省时间，选用PCR产物直接双酶切连。连啊连，一个月时间过去了，没一点效果，载体双酶切，分别单酶切，怎么做怎么没有，郁闷啊。 一天忽然心血来潮，给载体酶切位点测个序吧，顺便把PCR产物连个T载体也来测个序。这一测吓一跳，载体竟然不是我想要的载体，更为诡异的是引物的酶切位点竟然犹豫引物公司疏忽，把我的酶切位点和错了，无语了，叫天天不应，叫地地不灵啊。 收拾一番，重头再来。在去借了点目的载体，这次学乖了，载体来之后先去测个序，确定之后再接着往下做。PCR产物由于有前车之鉴，选择先连T载体，测序，再连接。酶切位点没错，引物合成没问题，载体没问题。但是更为诡异的事情出现了。基因突变，我PCR啊PCR啊，从普